黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶實(shí)驗(yàn)1

1、nn曲霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn)一、試驗(yàn)?zāi)康?、了解纖維素酶的生產(chǎn)工藝和原理2、把握液體發(fā)酵和固體發(fā)酵工藝3、學(xué)會(huì)DNS法測(cè)定還原糖含量的方法和原理二、試驗(yàn)原理纖維素酶可以用于一切含纖維素的生物質(zhì)的降解，具有寬闊的應(yīng)用前景。高 產(chǎn)纖維素酶的微生物主要有木霉屬、曲霉屬、根霉屬，黑曲霉所產(chǎn)的纖維素酶中 8 -葡萄糖甘酶活力高，能避開(kāi)酶解產(chǎn)物纖維二糖的阻遏作用，而且平安無(wú)毒， 故而成為生產(chǎn)纖維素酶的主要菌種之一。纖維素酶是誘導(dǎo)酶，故發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)需有 纖維素物質(zhì)作誘導(dǎo)劑。以竣甲基纖維素鈉作底物，用發(fā)酵所得纖維素酶對(duì)底物進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解 液中的還原糖含量（以葡萄糖計(jì)），可以計(jì)算酶活力凹凸。還原糖與DNS反響

2、形 成棕色物質(zhì)，顏色深淺與糖含量成正比。三、材料與試劑配制1、生產(chǎn)菌種：黑曲霉2、斜面（活化）培育基：酵母膏0.4%,蛋白豚0.6肌可溶性淀粉1%, 葡萄糖0.9%,馬玲薯浸出液7%,瓊脂2%,陳海水（或人工海水）配制，。3 人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4 7H2 0 = 7. 0 g/L ;NH4N03 = 1 g/L ;KC1 =0. 7 g/ L ; NaH2P04 = 2. 0 g/ L ; Na2HP04 =3.0 g/ L , pH7. 4。4、微量元素液： FeS04 7H2O 5. Omg/L , MnS04 H20 1. 6mg/L , ZnSO. 7H2

3、0 1.4mg/L, CoCl2 2. Omg/L,加蒸偏水 200nli 使之溶解。5、液體發(fā)酵產(chǎn)酶培育基：款皮作碳源3 g,氯化錢(qián)或硫酸錢(qián)作無(wú)機(jī)氮 源1 g,蛋白陳0.05g作有機(jī)氮源，人工海水100 ml （含1%微量元素液），自 然pH值。6、固體發(fā)酵產(chǎn)酶培育基：秋皮：稻草粉=2： 1作碳源5 g,人工海水12 ml (含1%微量元素液，1%氯化鏤或硫酸鏤，0.05%蛋白月東)，自然pH值。7、6%DNS試劑：稱取酒石酸鉀鈉182g溶于500nli水中，加熱溶解，于熱溶液中依次加入3, 5-二硝基水楊酸6g, 20. 8gNaOH, 5g苯酚，5g無(wú)水亞硫酸鈉, 加熱攪拌溶解，冷卻后定

4、容至1000mL儲(chǔ)存在棕色瓶中放置一周后使用。(提前 配制)8、0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液(pH 4.8)0.lmol/L檸檬酸鈉溶液100mL:稱2.941克檸檬酸鈉(檸檬酸鈉的分子量為294.12),約20L蒸儲(chǔ)水溶解后，轉(zhuǎn)入100mL溶量瓶，定容至刻度。0. lmol/L檸檬酸溶液100mL:稱2. 101克檸檬酸(檸檬酸的分子量為210. 14),約20L蒸儲(chǔ)水溶解后，轉(zhuǎn)入100mL溶量瓶，定容至刻度。pH4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液100mL:量取0. lmol/L檸檬酸鈉溶液 54mL和0. lmol/L檸檬酸溶液46mL混合搖勻。9、1%CMC-Na 溶液稱取

5、1. 0克竣甲基纖維素納，用pH 4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液加熱溶解。10、Img. mL-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液lmg/mL葡萄糖溶液250mL:精確稱取無(wú)水葡萄糖250mg,溶解定容到250ml。四、主要儀器恒溫培育箱，搖床培育箱，可見(jiàn)光分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、電子天公平。五、試驗(yàn)步驟1、培育基配制分別按上述方法配制液體發(fā)酵培育基和固體發(fā)酵培育基，121C滅菌20分鐘。2、胞子懸液的制備將斜面培育基上的曲霉抱子用少量無(wú)菌人工海水洗下，采用玻璃珠在磁力攪 拌下攪拌1520分鐘，充分打散抱子，稀釋成5x107個(gè)/ml左右的抱子懸液。3、液體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)按6% (v/v )接種量將濃度約為5義1

6、0 7個(gè)/ml的菌株胞子懸液接入已滅菌的液體發(fā)酵培育基（150 ml錐瓶裝液100 ml）,于35, 180r/min條件下?lián)u 床培育5天。發(fā)酵液4、5000 r/min離心15 min,上清液稀釋5倍，測(cè)定發(fā) 酵液中的酶活力。4、體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)100 ml三角燒瓶裝5g已滅菌的固體發(fā)酵培育基，按1:3（v/w）接種量將濃度 約為5義10 7個(gè)的菌株抱子懸液，于35c恒溫培育箱中培育，接種48小時(shí)后隔 天翻曲一次，第四或第五天補(bǔ)充無(wú)菌水保持基質(zhì)水分。培育5天后，取發(fā)酵成熟 曲1g,加蒸儲(chǔ)水10ml,攪拌勻稱，30,浸提lh,雙層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)4, 5000rmp離心15min,上清為粗酶液。

7、測(cè)定時(shí)適當(dāng)分級(jí)稀釋，使OD54O在0. 21. 0范 圍。5、酶活力測(cè)定及酶活力定義（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精確稱取無(wú)水葡萄糖250mg，溶解定容到250mlo分別吸取此液1.0, 2. 0, 3.0, 4. 0, 5.0 ml至5個(gè)25ml的比色管中,用蒸儲(chǔ)水定容到25nli （即 加水 24, 23, 22, 21, 20ml）再分別吸取上溶液各2. 5ml于比色管中（糖液分別含糖量為 0. 1,0. 2,0. 3, 0. 4, 0. 5mg）,各加 2. 5mlDNS 試劑,煮沸 5min。（比照管 2. 5ml 水 代替糖液，冷卻，測(cè)定0D54。表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制加樣表管號(hào)1234

8、56蒸儲(chǔ)水（mL）2.5一一標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖2.52.52.52.52.5(mL)DNS (mL)2.52.52.52.52.52.5含糖量（mg）00.10.20.30.40.5OD540以糖含量為橫坐標(biāo)，Am為縱坐標(biāo)，（或反過(guò)來(lái)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）酶活：取適當(dāng)稀釋的酶液0. 5 ml,加入2. 0 ml 1% (W/V)的CMC-Na溶液(溶于0. Imol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液,pH 4. 8), 60反響30 min,加入2. 5 ml DNS終止反響，沸水浴顯色5 min,測(cè)定OD54O。 以滅活酶液作比照。比照組：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 ml,加入2.

9、5 ml DNS 60反響30 min, 加入2.0 ml 1% (W/V)的CMC-Na溶液(溶于0. 1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖 液，pH 4. 8),沸水浴顯色5 min,測(cè)定OD540o(2)濾紙酶(FPA)酶活：取50 mg (IX 6 cm)新華濾紙，加入酶液0.5 ml, 再加入pH 4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液2. 0 ml, 60反響30min,其它同前。比照組：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 ml, 60反響30min,加入2. 5 ml DNS、2.0 mlpH 4. 8的檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液、50 mg (IX 6 cm)新華濾紙，沸水浴5min, 測(cè)定0D540

10、o酶活力定義：在上述反響條件下，每分鐘催化底物水解生成1 Mmol葡萄糖 所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。酶活力二mz、式中卜為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或回歸方程算得的還30 x0.5x 180原糖含量，mgo六、數(shù)據(jù)處理.試驗(yàn)紀(jì)錄(1)菌體每天的生長(zhǎng)狀況：第一天黑曲霉沒(méi)多大的變化，其次天時(shí)黑曲霉 已擴(kuò)散快速，開(kāi)頭變白，第三天培育基上已經(jīng)有一層白色的菌落，第四天菌落由 白色已經(jīng)漸漸的變成鮮黃色，第五天培育基上的菌落已經(jīng)變成了黑色厚絨狀。(2)酶活的測(cè)定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)紀(jì)錄：CMCase 酶活：液體發(fā)酵產(chǎn)酶的測(cè)量數(shù)據(jù)如表1：平均比照組(5400. 0000. 0000. 0000. 000試驗(yàn)組0D5400.

11、 2210. 2210. 2210. 221固體發(fā)酵產(chǎn)酶的測(cè)量數(shù)據(jù)如表2：*-平均比照組0D5400. 0000. 0000. 0000. 000試驗(yàn)組0D5400. 4010. 4010. 4000. 401FPA酶活:vi液體發(fā)酵產(chǎn)酶的測(cè)量數(shù)據(jù)如表3：.平均比照組OD54o0. 0000. 0000. 0000. 000試驗(yàn)組od54O0. 2360. 2350. 2360. 2362固體發(fā)酵產(chǎn)酶的測(cè)量數(shù)據(jù)如表4：.平均比照組OD5400. 0000. 0000. 0000. 000試驗(yàn)組OD54O0. 5480. 5480. 5480. 548表5葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制加樣表管號(hào)123456

12、蒸儲(chǔ)水(mL)2. 5標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖(mL)2. 52. 52. 52. 52.5DNS (mL)2.52. 52.52.52. 52.5含糖量(mg)00. 10.20.30.40. 5OD540 /測(cè)量次數(shù)0. 0000.0110. 1950. 3830. 5630. 8920. 0000.0110. 1940. 3830. 5630. 906*0. 0000.0110. 1950. 3830. 5640. 907平均0. 0000.0110. 1950. 3830. 5630. 902葡萄糖稀釋兩倍后的含糖量:試管號(hào)123456含糖量 (mg)00.050.10.150.20.2500. 0

13、50. 10. 150.20.25含糖量(mg)酶活力二Ax5xl00030 x0.5x180依據(jù)上表數(shù)據(jù)，以糖含量為橫坐標(biāo)，A54。為縱坐標(biāo)可繪制以下標(biāo)準(zhǔn)曲線:標(biāo)準(zhǔn)曲線0000. 9000. 8000. 7000. 600.5000. 4000. 3000. 2000. 1000. 000.酶活測(cè)定結(jié)果(1)內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)酶活：液體發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活力計(jì)算:且依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及表1的數(shù)據(jù)可以得到，A=0. lOlmg 所以酶活力*器U黑=87(U/m】)固體發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活力計(jì)算: 同理可得,A=0. 155mg船、工為Ax5xl000 0.155x5x1000 Q 0rlem、所以,酶活力=2. 870 (U/g)30 x0.05x18030 x0.05x180(2)濾紙酶酶活測(cè)定的計(jì)算：液體發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活力計(jì)算: 同理可得,A=0. llmg所以，酶活力二一X5X1000 R. 203(u/ml)30 x0.5x180固體發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活力計(jì)算：同理可得,A=0. 19mg所以，酶活力:一* 5x1000 =3. 518 (U/g)30 x0.05x180.結(jié)果分析和爭(zhēng)論由以上計(jì)算可得，本次試驗(yàn)測(cè)得的酶活力較低。而導(dǎo)致消失這樣結(jié)果偏差的 緣由有一下幾點(diǎn)：接種培育階段：.在接種期間對(duì)于無(wú)菌環(huán)境的試