免疫沉淀試驗

1、關于免疫沉淀試驗第一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 教 學 目 的掌握：液相內(nèi)沉淀試驗、凝膠內(nèi)沉淀試驗原理熟悉：沉淀反應的特點、免疫電泳技術、沉淀反應的應用第二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、基本原理免疫沉淀反應（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原與相應抗體在適當條件下發(fā)生特異性結合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié) 免疫沉淀試驗的基本原理第三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月形成肉眼可見的大的免疫復合物。第一階段第二階段沉淀反應分兩個階段抗原抗體特異性結合，快速但不可見第四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月環(huán)狀沉淀試驗絮狀

2、沉淀試驗免疫濁度測定免疫擴散試驗免疫電泳技術液體內(nèi)沉淀試驗凝膠內(nèi)沉淀試驗二、免疫沉淀試驗的分類第五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 階段性2. 特異性3. 抗原性質：可溶性4. 抗體的選擇：2價 三、 免疫沉淀試驗的特點第六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 液體免疫沉淀試驗第七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、絮狀免疫沉淀試驗絮狀免疫沉淀試驗是將抗原與相應抗體混合，在電解質存在的條件下，抗原抗體結合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。第二節(jié) 液體免疫沉淀試驗第八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：

3、抗原抗體最適比例一、絮狀免疫沉淀試驗第九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖 混勻、37孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉示意圖淀AgAbAg第十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月最適比方陣測定法第十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 原理： 當可溶性抗原與相應抗體特異結合，二者比例合適時，在增濁劑中它們快速形成一定大小的抗原抗體復合物，使反應液體出現(xiàn)濁度。 二、免疫濁度測定第十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu) 點：穩(wěn)定性好、簡便快速，易于

4、自動化敏感度高精確度高無放射性核素污染第十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.根據(jù)反應的時間和反應結合的動力學分為 速率比濁法 終點比濁法 2.根據(jù)檢測儀器的位置及光信號性質分為 透射免疫比濁法 散射免疫比濁法3.免疫膠乳比濁法分 類：第十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 透射比濁試驗和散射比濁試驗光路檢測器A檢測器B IC I0 I I 透射比濁試驗 散射比濁試驗當復合物3106dal，II;90，散射光的量代表IC的量。第十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）抗原抗體的比例：反應體系保持抗體過量（2）抗體的質量 ：特異性強，效價高，親和力強，并使用R型

5、抗體 （3）抗原抗體反應液的環(huán)境：最適PH為6.5-8.5 （4）增濁劑補充：免疫濁度測定影響因素第十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）抗原抗體的比例第十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 在抗體過量的反應體系中,抗原量的遞增與比濁定量成正比,當抗原抗體比例合適時反應達峰值,而當抗原過量時,形成的免疫復合物分子小,濁度反而下降的一個拋物曲線。海德堡曲線第十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）抗體的質量抗體的特異性抗體的效價(1:20)抗體的親和力R型和H型抗體（R型）第十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）抗原抗體反應的環(huán)境最適PH為：6.

6、5-8.5離子強度大，IC形成快離子種類的影響，常用磷酸鹽緩沖液（4）增濁劑PEG(60008000) 濃度4%吐溫-20第二十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.抗血清中有非特異性的交叉反應性雜抗體成分2.增濁劑濃度和反應時間掌握不當3.樣品本身的濁度處理不當4.試劑污染變質5.比色杯不夠清潔 偽濁度形成的原因第二十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗第二十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗第二十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 可溶性抗原和相應抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比

7、例適當?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。 原理第二十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月反應介質：凝膠凝膠的特點：1、固相的液體2、多孔的網(wǎng)狀結構3、Ag-Ab復合物網(wǎng)絡在凝膠中第二十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關。技術要點：1.制板2.打孔3.加樣4.擴散 5.繪制標準曲線定量試驗一、單向免疫擴散試驗 第二十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環(huán) 一、單向免疫擴散試驗第二十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022

8、年6月第二十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月T1為16-24h；T2為24-48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線t1為16-24h；t2為24-48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線第二十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月待檢蛋白質抗原須具備的條件僅針對某待測抗原的單價特異性抗血清已知含量的標準品待測品含量在1.25g/ml以上第三十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月單向擴散試驗上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清一、單向免疫擴散試驗第三十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)

9、作于2022年6月應 用IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白的檢測第三十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月技術要點： 1.制板 2.打孔 3.加樣 4.擴散二、雙向免疫擴散試驗 第三十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.判斷抗原或抗體的存在以及估計相對含量2.分析抗原或抗體相對分子量 二、雙向免疫擴散試驗第三十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.分析抗原的性質二、雙向免疫擴散試驗 第三十七張，PPT共七十八頁，

10、創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4.滴定抗體的效價5.鑒定抗原或抗體純度 二、雙向免疫擴散試驗 第三十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 應 用 1.AFP檢測的最早方法 2.血清中含量較高的酶類、細菌病毒感染后血清中產(chǎn)生的抗體的檢測第四十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、免疫電泳技術第四十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 優(yōu)點： 1.加快反應的速度。 2.提高了靈敏度。3.增加了分辨率。 電泳分析沉淀反應抗原抗體反應的高度特異性電泳技術的高分辨率、快速、微量三、免疫電泳技術第四十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6

11、月電泳（electrophoresis） ：在外加電場的作用下帶電顆粒向著其電性相反的電極移動，稱為電泳。 第四十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳遷移率： 定義：同一電場條件下，各種帶電粒子在 單位時間內(nèi)移動的距離。M=cm2/VS影響泳動的速度的因素: 本身凈電荷量、顆粒大小、形狀 電場強度 溶液pH值 溶液離子強度 電 滲 第四十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電滲： 電場中液體相對于固體的運動 載體的性質 緩沖液的離子強度 電泳時的電壓第四十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電滲方向與樣品運動方向一致： 樣品遷移率加快 電滲方向與樣品運動方向不一致：

12、 樣品遷移率降低，甚至倒退 第四十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳載體： 瓊脂 瓊脂糖凝膠 常用濃度：0.8%-1.0% 特點:雜質少、接近電中性，常溫易凝固，色澤透明、質地均勻、富有彈性。第四十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質的兩性解離性質： -NH2 + H2O -NH3+ + OH- -COOH -COO- +H+ 兩性離子pH=pI 電中性，無電泳移動性pHpI 堿性溶液 帶負離子，向陽極泳動第四十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：雙向擴散+電泳實質上是定向加速度的免疫雙擴散技術 比雙向擴散試驗靈敏度提高816倍（一）對流免疫電泳第四十

13、九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月通電蛋白質抗原常帶較強的負電荷，在電場中向正極移動抗體球蛋白帶負電荷較少，籍電滲作用向負極泳動 （一）對流免疫電泳第五十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月結果分析：無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。（一）對流免疫電泳第五十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月技術評價： 1.簡便、快速,敏感度較雙擴提高8-16倍，可測蛋白質濃度達 ug/ml. 2.要求抗原、抗體比例嚴格3.不適宜抗原抗體都是球蛋白的檢測 第五十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2

14、022年6月 抗原抗體分子復合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復合物沉淀峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關。 單向免疫擴散電泳,定量檢測技術（二）火箭免疫電泳第五十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.2%巴比妥瓊脂糖約55，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負極側， 6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標準曲線，求出待測樣品濃度。技術要點（二）火箭免疫電泳第五十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月火箭免疫電泳圖為標準抗原；為標本-+（二）火箭免疫電泳示意圖第五十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月結果判定： 1、定性：直

15、接觀察、染色 2、定量：根據(jù)峰高-濃度標準曲線計算3、為提高靈敏度，可加入少量125I標記的標準抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的火箭峰第五十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：區(qū)帶電泳雙向擴散1、將蛋白質抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶 2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應抗血清進行雙向擴散 （三）免疫電泳第五十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)各蛋白所處的電泳位置,可分為:白蛋白區(qū)、球蛋白區(qū)、1區(qū)、2區(qū)、區(qū)、區(qū) + -ALB 1 2 白蛋白 抗胰蛋白酶 觸珠蛋白 轉鐵蛋白 IgG前白蛋白 酸糖蛋白 銅藍蛋白 C3aC3b CRP1脂蛋

16、白 抗糜蛋白酶 巨球蛋白第五十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.純化抗原和抗體成分的分析2.正常及異常免疫球蛋白的識別與鑒定應用免 疫 電 泳第六十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月-+（三）免疫電泳示意圖第六十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月技術評價： 1.分辨率較高 2.僅定性 3.擴散時間長，影響因素多，結果較難分析4.目前大量應用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識別與鑒定。第六十五張，PP

17、T共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應，在適當位置形成抗原抗體復合物，經(jīng)染色后，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型 原理區(qū)帶電泳沉淀反應（四）免疫固定電泳第六十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月左圖為IgG 型, 中圖為IgG 型，右為正常 SPGAM SPGAM SPGAM （四）免疫固定電泳示意圖第六十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理： 待檢蛋白電泳 固定劑及各類抗血清加于凝膠表面的泳道 抗原與對應抗體反應 沉淀 漂洗 染色 某一抗原的存在? 第六十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時，

18、結果易于分析。 應用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質的檢測與、分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測與分型。優(yōu)點（四）免 疫 固 定 電 泳第六十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月應用:M 蛋白的鑒定和分型第七十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）交叉免疫電泳（六）自動化免疫電泳第七十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 免疫沉淀試驗的臨床應用免疫濁度法：蛋白質的檢測如免疫球蛋白、補體、類風濕因子、C反應蛋白等第七十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 臨床常用免疫沉淀試驗試劑方法特點一、膠乳增強的透射免疫比濁試驗在全自動生化分析儀中的應用二、膠乳增強的透射免疫比濁試驗在血凝固分析儀中的應用三、免疫固定電泳在半自動電泳儀中的應用四、散射免疫比濁試驗在特種蛋白免疫分析儀中的應用第七十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 影響免疫沉淀試驗的主要因素如溫度、電解質、酸堿度等第七十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月名詞: 沉淀反應簡答: 1.雙向免疫擴散試驗的應用2.免疫電泳技術的類型思 考 題第七十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.根據(jù)海德堡曲線理論，下列說法不正確的是A 抗原