血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合應(yīng)用對鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與堿性磷酸酶活性的影響

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合應(yīng)用對鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與堿性磷酸酶活性的影響 中國組織工程研究 第21卷 第4期 20170208出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 8, 2017 Vol.21, No.4 www. CRTER.org 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合應(yīng)用對 鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與堿性磷酸酶活性的影響 研究原著 曹 宇1，王莉莉2 (1沈陽市第六人民醫(yī)院口腔科，遼寧省沈陽市 110000；2錦州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科，遼寧省錦州市 121004) 引用

2、本文：曹宇,王莉莉. 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合應(yīng)用對鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖與堿性磷酸酶活性的 影響J.中國組織工程研究，2017，21(4):580-585. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.015 ORCID: 0000-0002-1451-9087(曹宇) 文章快速閱讀： 文題釋義： 牙周組織工程：是將種子細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，將擴(kuò)增的細(xì)胞與具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，形成細(xì)胞-材料復(fù)合物，將此復(fù)合物植入機(jī)體牙周病損區(qū)，以達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。 生長因子：是一類通過與特異

3、的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與其他細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽類物質(zhì)。存在于血小板和各種成體與胚胎組織及大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞中，對不同種類細(xì)胞具有一定的專一性。 摘要 方法：體外培養(yǎng)大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞并鑒定其胚胎來源，第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；檢測不同濃度血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響，并從中確定顯效濃度及最大效應(yīng)濃度；將細(xì)胞分為5組，分別為A組：對照組，為含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的DMEM；B組：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度組；C組：堿性成纖維細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度組；D組：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子顯效濃度與堿性成纖維細(xì)胞生長因子顯效濃度聯(lián)合應(yīng)用；E

4、組：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度與堿性成纖維細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度聯(lián)合應(yīng)用。于3，7，14 d后，測定5組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。 結(jié)果與結(jié)論：培養(yǎng)的大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)良好，來源于中胚層；隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子質(zhì)量濃度的增加，大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖能力也隨之提高(P 0.01)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的顯效濃度為10 g/L，最大效應(yīng)濃度為100 g/L；堿性成纖維細(xì)胞生長因子的顯效濃度為 0.1 g/L，最大效應(yīng)濃度為10 g/L；當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合作用于大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞時，實(shí)驗(yàn)各組A值均高于對照組。在應(yīng)用3 d和7

5、 d時，但D組A值顯著低于E組(P 0.05)，14 d時2組差異無顯著性意義。結(jié)果說明，在一定作用時間內(nèi)，最大效應(yīng)濃度聯(lián)合應(yīng)用對堿性磷酸酶的活性能起到明顯的協(xié)同作用，但超過某一時間，顯效濃度同最大效應(yīng)濃度對于牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性沒有差異。這可能與兩因子的作用時效及牙周膜細(xì)胞的受體有關(guān)。 關(guān)鍵詞： 組織構(gòu)建；組織工程；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；血管內(nèi)皮生長因子；牙周膜成纖維細(xì)胞；體外培養(yǎng)；增殖；堿性磷酸酶 主題詞： 成纖維細(xì)胞生長因子2；血管內(nèi)皮生長因子；牙周膜；堿性磷酸酶 基金資助： 遼寧省科技廳自然科學(xué)基金優(yōu)秀人才培育項(xiàng)目(2014022003)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(2015

6、10160000045) 580 P.O. Box 10002, Shenyang 曹宇，女，1974年生，遼寧省鞍山市人，漢族，2001年中國醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)，副主任醫(yī)師，主要從事口腔醫(yī)學(xué)研究。 通訊作者：王莉莉，博士，副主任醫(yī)師，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科，遼寧省錦州市 121004 中圖分類號:R318 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:2095-4344 (2017)04-00580-06 稿件接受：2016-12-12 Cao Yu, Associate chief physician, Department of Stomatology, the Sixth Peoples Hospita

7、l of Shenyang, Shenyang 110000, Liaoning Province, China Corresponding author: Wang Li-li, M.D., Associate chief physician, Department of Prosthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121004, Liaoning Province, China www.CRTER.org 110180 www.CRTER.org

8、Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on periodontal ligament fibroblast proliferation and alkaline phosphatase activity in rats Cao Yu1, Wang Li-li2 (1Department of Stomatology, the Sixth Peoples Hospital of Shenyang, Shenyang 110000, Liaoning Pr

9、ovince, China; 2 Department of Prosthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121004, Liaoning Province, China) Abstract BACKGROUND: Basic fibroblast growth factor (bFGF) can enhance fibroblast proliferation and collagen deposition, and vascular endothe

10、lial growth factor (VEGF) can improve blood perfusion and metabolic level of pathological tissues. Additionally, both of them can boost the alkaline phosphatase activity under given conditions. OBJECTIVE: To evaluate the effect of bFGF combined with VEGF on the periodontal ligament fibroblast prolif

11、eration and alkaline phosphatase activity in rats. METHODS: Rat periodontal ligament fibroblasts were cultured in vitro, its embryonic origin was identified and passage 4 cells were used for the following experiments. Effects of bFGF and VEGF with different concentrations on the rat periodontal liga

12、ment fibroblast proliferation were detected to determine the minimum and maximum effective concentrations. Cells were divided into five groups: group A (control group) with DMEM containing 2% fetal bovine serum; group B as maximum effective concentration of VEGF group; group C as maximum effective c

13、oncentration of bFGF; group D as minimum effective concentration of bFGF combined with minimum effective concentration of VEGF group; group E as maximum effective concentration of bFGF combined with maximum effective concentration of VEGF group. At 3, 7 and 14 days, the alkaline phosphatase activity

14、 in each group was detected. RESULTS AND CONCLUSION: Rat periodontal ligament fibroblasts derived from the mesoderm grew well. Rat periodontal ligament fibroblast proliferation was increased with the VEGF and bFGF concentration increasing (P 0.01). The maximum and minimum effective concentrations of

15、 VEGF were 100 and 10 g/L, and the maximum and minimum effective concentrations of bFGF were 10 and 0.1 g/L. The absorbance values in the groups D and E were higher than those in the group A. The absorbance values of the group D were significantly lower than those of the group E at 3 and 7 days (P 0

16、.05). To conclude, the combination use of the maximum effective concentration of VEGF and bFGF can play a significant synergistic effect on the alkaline phosphatase activity at a given time, but the minimum and maximum effective concentrations show no significant differences if not in the given time

17、, which may be related to the time-effectiveness of these two factors and the receptors of periodontal ligament cells. Subject headings: Fibroblast Growth Factor 2; Vascular Endothelial Growth Factors; Alkaline Phosphatase; Tissue Engineering Funding: the National Science Foundation for the Talents

18、of Liaoning Science and Technology Department, No. 2014022003; the Innovation Training Program of College Students of Liaoning Province, No. 201510160000045 Cite this article: Cao Y, Wang LL. Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on periodontal li

19、gament fibroblast proliferation and alkaline phosphatase activity in rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(4):580-585. 0 引言 Introduction 社會在不斷進(jìn)步，人們的保健意識也在不斷增強(qiáng)，但是牙周疾病的發(fā)病率仍居高不下1。牙周病是一種慢性炎癥破壞性非特異感染性疾病，影響其治療效果的主要因素就是牙周組織損傷后，炎癥抑制了牙周正常組織的再生及重建2。這些年來，學(xué)者一直致力于通過組織工程技術(shù)來促進(jìn)牙周組織的再生及重建3-6。種子細(xì)胞、支架材料、生長因子是

20、實(shí)施該技術(shù)的三大元素7。近些年來，生長因子受到了越來越多的關(guān)注8。在眾多的生長因子中，堿性成纖維細(xì)胞生長因子及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子發(fā)揮了非常重要的作用9。前者可以提高成纖維細(xì)胞的增殖及膠原的沉積能力10-11，后者可改善病變組織的血流灌注和新陳代謝水平12，且兩者在適當(dāng)?shù)臐舛取r間作用下，均可增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性13-14。堿性成纖維細(xì)胞生長因子與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子單獨(dú)作用于牙周膜成纖維細(xì)胞已有過報道，但是兩者聯(lián)合應(yīng)用的報道尚不多見15。文章通過單獨(dú)應(yīng)用不同濃度的這兩種因子作用于大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞，確定出顯效濃度及最大效應(yīng)濃度，進(jìn)一步以實(shí)驗(yàn)確定的濃度將兩種因子聯(lián)合應(yīng)用，探討其對大鼠牙周膜成

21、纖維 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的影響。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 分組對照細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。 1.2 時間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2015年12月完成于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。 1.3 材料 1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物 2月齡、體健、體質(zhì)量100-120 g的SD雄性大鼠由錦州醫(yī)科大學(xué)動物研究中心提供，動物研究中心許可證號：SCXK(遼)2003-2007。 1.3.2 主要試劑及材料 含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Hyclone，美國)、PBS(Amresco，美

22、國)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Cytokine，USA)、堿性磷酸酶測定試劑盒；25 cm2與75 cm2培養(yǎng)瓶、24孔板與96孔板、15 mL 離心管；一次性濾器。 1.3.3 主要儀器 CO2孵箱(Shellab，美國)、ZHJH- C1118C 型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)、CKX41 型倒置相差顯微鏡、DT5-1低速離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀：國營華東電 581 www.CRTER.org 子管廠產(chǎn)DG3022A型；5y2002 型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。 1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1.4.1 大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞的

23、培養(yǎng)及胚胎來源的鑒定取2月齡SD大鼠，分離其上下頜骨及磨牙，漂洗10次，刮取根中部1/3的牙周膜組織，剪成1 mm1 mm的碎屑，采用酶消化法結(jié)合組織塊法，將消化后的組織塊平鋪于培養(yǎng)皿內(nèi)，將此培養(yǎng)皿倒置放置于CO2孵箱內(nèi)(37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，100%濕度)。待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底達(dá)60%時，進(jìn)行首次傳代。用0.25%胰酶進(jìn)行消化，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，待細(xì)胞回縮呈圓形時，棄掉胰酶，再加入含15%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清的DMEM 2 mL，反復(fù)吹打，重新分散細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。以后待細(xì)胞長滿瓶底時，按12進(jìn)行傳代。第3代細(xì)胞用于細(xì)胞來源鑒定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 1.4.2

24、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖作用的影響 取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞，消化、離心后將其調(diào)整為細(xì)胞濃度為2107 L-1的細(xì)胞懸液。在96孔板的每個孔中滴加100 L的細(xì)胞懸液，并補(bǔ)充體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液至 200 L，并于CO2孵箱內(nèi)(37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，100%濕度)孵育24 h后，將原培養(yǎng)液棄去，PBS沖洗3次。將孔板細(xì)胞隨機(jī)分為8組，其中6組分別注入不同濃度的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，即為實(shí)驗(yàn)組(A組：0.5 g/L；B組：10 g/L；C組：25 g/L；D組：50 g/L；E組：100 g/L；F組： 200 g/L)，1個陰性對

25、照組(不含血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子組)，1個空白對照組(只含DMEM培養(yǎng)液)，每組6孔，CO2孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。3 d后棄去上述培養(yǎng)液，注入MTT液 (5 g/L)20 L，CO2孵箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)后，各孔內(nèi)均加入150 L二甲基亞砜，震蕩搖勻，以使孔板中的結(jié)晶物質(zhì)充分的溶解。于490 nm波長下檢測各孔的A值，結(jié)果取均值，從中選出顯效濃度及最大效應(yīng)濃度。 1.4.3 堿性成纖維細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖作用的影響 取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞，消化、離心后將其調(diào)整為細(xì)胞濃度為2107 L-1的細(xì)胞懸液。在96孔板的每個孔中滴加100 L的細(xì)胞懸液，并補(bǔ)充體積分?jǐn)?shù)1

26、0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液至 200 L，并于CO2孵箱內(nèi)(37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，100%濕度)孵育24 h后，將原培養(yǎng)液棄去，PBS沖洗3次。將孔板細(xì)胞隨機(jī)分為6組，其中4組分別注入不同濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長因子，即為實(shí)驗(yàn)組(A組：0.1 g/L；B組： 1 g/L；C組：10 g/L；D組：100 g/L)，1個陰性對照組(不含血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子組)，1個空白對照組(只含DMEM培養(yǎng)液)，每組6孔，CO2孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。3 d后棄去上述培養(yǎng)液，注入MTT液(5 g/L)20 L，CO2孵箱中孵育 4 h，終止培養(yǎng)后，各孔內(nèi)均加入150 L二甲基亞砜，震蕩搖勻，以使孔板中的結(jié)晶物

27、質(zhì)充分的溶解。于490 nm波長 582 下檢測各孔的A值，結(jié)果取均值，并繪制生長曲線，從中選出顯效濃度及最大效應(yīng)濃度。 1.4.4 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子聯(lián)合應(yīng)用對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞用于此實(shí)驗(yàn)，將其制成2107 L-1的細(xì)胞懸液。根據(jù)1.4.2及1.4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分為5組，A組：對照組為含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的DMEM；B組：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度組；C組：堿性成纖維細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度組；D組：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子顯效濃度與堿性成纖維細(xì)胞生長因子顯效濃度聯(lián)合應(yīng)用；E組：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度與

28、堿性成纖維細(xì)胞生長因子最大效應(yīng)濃度聯(lián)合應(yīng)用。每組6孔，接種于96孔板中，每孔滴加100 L此細(xì)胞懸液，于CO2孵箱內(nèi)(37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，100%濕度)常規(guī)培養(yǎng)，每3 d換液1次。待細(xì)胞生長融合至培養(yǎng)板底的70%-80%時，各組加入含有相應(yīng)濃度生長因子的成骨誘導(dǎo)液(成骨誘導(dǎo)液成分：含50 mg/L維生素C、1105 mol/L 地塞米松、10%胎牛血清、1102 mol/L -甘油磷酸鈉的DMEM 培養(yǎng)液)，每3 d換液1次。分別于誘導(dǎo)7 d后的第3，7，14天檢測各組的堿性磷酸酶活性。于405 nm波長下檢測各孔的A值，按以下公式計(jì)算出堿性磷酸酶的活性： 堿性磷酸酶=(測定孔吸光度-

29、空白孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度-空白孔吸光度)酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度/待測樣本蛋白濃度，結(jié)果取均值。 1.5 主要觀察指標(biāo) 大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)；血 管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響；堿性成纖維細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響；兩種因子聯(lián)合應(yīng)用對大鼠牙周膜成纖維細(xì) 胞堿性磷酸酶活性的影響。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測，計(jì)量資料以x_ s來表示，對于各組間的差異比較，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P 0.05為差異有顯著性意義。 2 結(jié)果 Results 2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 2 d后，可見其從組織

30、塊邊緣游出，生長狀態(tài)良好。細(xì)胞呈長梭形、紡錘形，呈現(xiàn)多形性。傳代后的細(xì)胞逐漸純化，生長旺盛，形態(tài)理想，呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞的典型形態(tài)。經(jīng)波形絲蛋白及角化蛋白的免疫組化染色證實(shí)，此牙周膜成 纖維細(xì)胞來源于中胚層。 對加入不同濃度血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子的大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行鏡下觀察，培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞生長正常，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形，偶有細(xì)胞脫落。培養(yǎng)72 h后，見各組細(xì)胞仍 全部貼壁生長，細(xì)胞輪廓清晰，核漿比例正常，胞質(zhì)均勻(見圖1，2)。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org www.CRTER.org 圖 1

31、加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子細(xì)胞培養(yǎng)72 h(100) Figure 1 Cells cultured for 72 hours after the addition of vascular endothelial growth factor (100) 圖2 加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子細(xì)胞培養(yǎng)72 h (200) Figure 2 Cells cultured for 72 hours after the addition of basic fibroblast growth factor (200) 2.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖作用的影響 不同質(zhì)量濃度血管內(nèi)皮細(xì)胞生長

32、因子作用于大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞3 d后，大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖能力均受到了不同程度的影響。隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子質(zhì)量濃度的增加，大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖能力也隨之提高，當(dāng)質(zhì)量濃度為200 g/L時，A值沒有進(jìn)一步增高，但各實(shí)驗(yàn)組A值與對照組相比，均有顯著性差異(P 0.01)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的顯效濃度為10 g/L，最大效應(yīng)濃度為100 g/L(見表1)。 表1 培養(yǎng)3 d后不同質(zhì)量濃度血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜 成纖維細(xì)胞增殖作用的影響 (x_ s) Table 1 Effects of different concentrations of vascular endot

33、helial growth factor on the periodontal ligament fibroblast proliferation after 3-day culture 組別 A值 空白對照組 0.0030.001 陰性對照組 0.1950.024 A組 (0.5 g/L) 0.2030.012 B組(10 g/L) 0.2320.099a C組 (25 g/L) 0.2500.075a D組 (50 g/L) 0.2660.006a E組 (100 g/L) 0.2790.101a F組 (200 g/L) 0.2570.034a 表注：與對照組相比， aP 0.01。 2

34、.3 堿性成纖維細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞增殖作用的影響 不同質(zhì)量濃度堿性成纖維細(xì)胞生長因子作用于大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞 3 d后，隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子質(zhì)量濃度的增加，各組的A值也隨之增加，但10 g/L組A值高于其余各組(P 0.01)，各實(shí)驗(yàn)組A值與對照組相比，均有顯著性差異(P 0.05)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子的顯效濃度為0.1 g/L，最大效應(yīng)濃度為10 g/L(見表2)。 2.4 兩種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 各組隨著培養(yǎng)時間的延長，A值也在隨之增長，堿性磷酸酶的活性亦隨之增強(qiáng)。在培養(yǎng)3 d時，除血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(100 g/L)組外

35、，其余各組與對照組相比，均有顯著性差異(P 0.05)。7，14 d時，實(shí)驗(yàn)各組與對照組相比，亦均有顯著性差異(P 0.05)。但血管內(nèi) ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 皮細(xì)胞生長因子10 g/L+堿性成纖維細(xì)胞生長因子 0.1 g/L組與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子100 g/L+堿性成纖維細(xì)胞生長因子10 g/L組相比，在3 d和7 d時，前者A值低于后者(P 0.05)，見表3，圖3。 表 2 培養(yǎng)3 d后不同濃度堿性成纖維細(xì)胞生長因子對大鼠牙周膜成 纖維細(xì)胞增殖作用的影響 (x_ s) Table 2 Effects of different

36、 concentrations of basic fibroblast growth factor on the periodontal ligament fibroblast proliferation after 3-day culture 組別 A值 空白對照組 0.0090.001 陰性對照組 0.2010.035 A組(0.1g/L) 0.2380.026a B組(1 g/L) 0.2920.013b C組(10 g/L) 0.3750.008b D組(100 g/L) 0.3220.060b 表注：與對照組相比，a P 0.05，bP 0.01 表3 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖

37、維細(xì)胞生長因子聯(lián)合應(yīng)用對 大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響 (x_ s) Table 3 Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on the alkaline phosphatase activity of rat periodontal ligament fibroblasts 組別 3 d 7 d 14 d 對照組 0.1780.025 0.2320.028 0.3060.011 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(100 g/L) 0.1890.018

38、 0.2670.009a 0.3450.027a 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(10 g/L) 0.2010.007a 0.2880.016a 0.3820.019b 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子10 g/L+ 堿性成纖維細(xì)胞生長因子0.1 g/L 0.2170.021b 0.3030.010b 0.4110.012b 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子100 g/L+ 堿性成纖維細(xì)胞生長因子10 g/L 0.2550.031bc 0.3910.013bc 0.4290.015b 表注：與對照組相比，aP 0.05，b P 0.01。與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子10 g/L+ 堿性成纖維細(xì)胞生長因子0.1 g/L組相比，c P

39、 0.05。 對照組 (100 g/L) 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(10 g/L) 血管內(nèi)皮生長因子(10 g/L)+堿性成纖維細(xì)胞生長因子(0.1 g/L) 血管內(nèi)皮生長因子(100 g/L)+堿性成纖維細(xì)胞生長因子(10 g/L) 值A(chǔ) 3 d7 d14 d時間 圖3 兩種因子聯(lián)合應(yīng)用對大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的 影響 Figure 3 Effects of vascular endothelial growth factor combined with basic fibroblast growth factor on the alkaline phosphatase activ

40、ity of rat periodontal ligament fibroblasts 圖注：各組隨著培養(yǎng)時間的延長，A值也在隨之增長，堿性磷酸酶的 活性亦隨之增強(qiáng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子100 g/L+堿性成纖維細(xì)胞 生長因子10 g/L組堿性磷酸酶的活性最強(qiáng)。 583 www.CRTER.org 3 討論 Discussion 成纖維細(xì)胞是牙周組織的重要細(xì)胞成分，它可以誘導(dǎo)牙周組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞發(fā)揮潛在的生物學(xué)功能，其在牙周組織的修復(fù)過程中發(fā)揮了重要的作用16-17。在某些條件下，牙周膜成纖維細(xì)胞可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞18。由此可見，牙周膜成纖維細(xì)胞具有完全修復(fù)牙周

41、組織炎癥缺損、形成新附著的能力19。基于牙周膜成纖維細(xì)胞的這種多向分化的能力，它被廣泛的應(yīng)用于牙周再生領(lǐng)域20。 牙周組織再生中的一個至關(guān)重要的過程就是使牙周膜成纖維細(xì)胞在根面獲得黏附及足夠的冠方遷移。但這一過程受眾多因素的干擾，如細(xì)胞本身的增殖能力以及各種多肽生長因子對細(xì)胞活動的調(diào)控等21。堿性成纖維細(xì)胞生長因子是一種重要的促進(jìn)有絲分裂的生長因子，具有誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生和分化的能力22-23。在正常生理和病理活動中，它能夠參與生長發(fā)育及組織創(chuàng)傷的修復(fù)24。對于牙周炎來說，最終的治療目的是為了恢復(fù)損傷的牙周組織，使牙周組織重建，形成新的附著，堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合及組織的修復(fù)，可以

42、促進(jìn)牙周組織的修復(fù)和再生。動物實(shí)驗(yàn)證明，將堿性成纖維細(xì)胞生長因子用于牙周組織的重建中，它可以誘導(dǎo)牙髓、牙周膜成纖維細(xì)胞發(fā)生趨化作用，促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)的分泌25。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子是由牛垂體細(xì)胞體外培養(yǎng)分離出來的一種糖蛋白，它能夠增強(qiáng)微血管的通透性，促進(jìn)血漿蛋白的滲出，使血漿蛋白直接或間接的改變細(xì)胞外基質(zhì)的成分，促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞的遷移26-27。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它在骨組織再生中也能起到調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)，使其礦化能力得到增強(qiáng)28。 對于牙周組織工程來說，選擇合適的生長因子至關(guān)重要。合適濃度的生長因子可以使細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用發(fā)揮到最佳，對牙周組織的再

43、生起到最大的幫助。但既往的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的有效濃度，結(jié)果不盡相同29-30。實(shí)驗(yàn)中將不同濃度的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子刺激于大鼠的牙周膜成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)，各濃度的這兩種因子對牙周膜成纖維細(xì)胞都有一定的促進(jìn)作用。其中，隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子濃度的提高，其增殖能力也在提高，但質(zhì)量濃度到達(dá)200 g/L時，盡管也有增殖能力，但沒有得到與濃度呈正相關(guān)的提高。與對照組相比，其顯效濃度為10 g/L，最大效應(yīng)濃度為 100 g/L，在一定范圍內(nèi)呈一定的濃度依賴性。同樣，堿性成纖維細(xì)胞生長因子對牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖也有一定的促進(jìn)作用，隨著堿性成纖維細(xì)胞生長因子濃度

44、的增長，其增殖能力也在不斷提高，但其增殖的峰值出現(xiàn)在10 g/L時，顯效濃度為0.1 g/L。說明當(dāng)堿性成纖維細(xì)胞生長因子到達(dá)一定濃度劑量的時候，即使再提高濃度也不會對牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖能力有所幫助，這與Luo等31實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。以上實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了這2種因子對牙周膜成纖維 584 細(xì)胞具有一定的促增殖作用，但這也與生長因子的濃度有一定關(guān)系。 為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道初步確定了2種因子的濃度范圍。從濃度范圍中，測定出了2種因子各自的促增殖最大效應(yīng)濃度及顯效濃度用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。研究證實(shí)，將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子以各自的顯效濃度和最大效應(yīng)濃度分別聯(lián)合應(yīng)用

45、于大鼠牙周膜成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對于堿性磷酸酶活性的影響具有一定的協(xié)同效應(yīng)。在3，7，14 d與對照組的A值相比，堿性磷酸酶活性均高于對照組，說明2種因子的聯(lián)合應(yīng)用并沒有抑制牙周膜成纖維細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。而且，在3，7 d時，最大效應(yīng)濃度兩因子聯(lián)合應(yīng)用(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子100 g/L+堿性成纖維細(xì)胞生長因子10 g/L)的效果明顯高于顯效濃度兩因子聯(lián)合應(yīng)用(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子10 g/L+堿性成纖維細(xì)胞生長因子0.1 g/L) (P 0.05)，最大效應(yīng)濃度組的堿性磷酸酶活性并沒有預(yù)期所設(shè)想的隨著濃度的提高而相應(yīng)的提高。分析其原因，這可能是隨著時間的增長，堿性成纖維細(xì)胞生長因子對牙周膜細(xì)

46、胞具有抑制成骨的作用，相應(yīng)的減少了牙周膜細(xì)胞表面的堿性成纖維細(xì)胞生長因子受體，降低了堿性磷酸酶的活性32，出現(xiàn)了與顯效濃度組無差異的結(jié)果。 作者貢獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及評估為通訊作者王莉莉，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為曹宇，是盲法評估。 利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章無相關(guān)利益沖突。 倫理問題：實(shí)驗(yàn)動物在戊巴妥納麻醉下進(jìn)行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。 文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。 文章外審：本刊實(shí)行雙盲外審制度，文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。 作者聲明：文章第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)

47、(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。 文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。 開放獲取聲明：這是一篇開放獲取文章，文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。根據(jù)知識共享許可協(xié)議“署名-非商業(yè)性使用-相同方式共享3.0”條款，在合理引用的情況下，允許他人以非商業(yè)性目的基于原文內(nèi)容編輯、調(diào)整和擴(kuò)展，同時允許任何用戶閱讀、下載、拷貝、傳遞、打印、檢索、超級鏈接該文獻(xiàn)，并為之建立索引，用作軟件的輸入數(shù)據(jù)或其它任何合法用途。 4 參考文獻(xiàn) References 1 Li LW, Wong HM, Sun L,et al.Anthro

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