基因工程技術(shù)在改進微生物菌種方面的應(yīng)用課件

1、基因工程技術(shù)在改進微生物菌種方面的應(yīng)用主要應(yīng)用: 1. 提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量 2. 改進代謝產(chǎn)物的組分 3. 改進菌種的生理性能 4. 產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物 (一) 提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段1. 增加限速酶的基因拷貝數(shù)2. 增加正調(diào)節(jié)基因,去除負調(diào)節(jié)基因3. 增加抗性基因的拷貝數(shù)1. 增加限速酶的基因拷貝數(shù)原理： Ea Eb Ec Ed A B C D E ( 代謝產(chǎn)物） 限速酶 Rate-limiting Bottleneck Ea Eb Ec 例1: 起始原料 ACV三肽 異青霉素N 青霉素 -aminoadipic acid L-cysteine Ea:

2、ACV合成酶 Ec:異青霉素N?；饷?L-valine Eb:異青霉素N合成酶 青霉素?；D(zhuǎn)移酶 異青霉素N合成酶對P.chrysogenum青霉素產(chǎn)量的影響 菌株 原始菌株 低產(chǎn)菌株 高產(chǎn)菌株 Wis 54-1255 AS-P-78 IPNS 的基 1 - 9-14 因拷貝數(shù) mRNA量 1 - 32-64 青霉素產(chǎn)量 100% 導(dǎo)入帶IPNS 140% 的基因片段 增加IPNS基因提高青霉素產(chǎn)量轉(zhuǎn)化青霉素產(chǎn)生菌 Wis54-1255轉(zhuǎn)化菌株青霉素V產(chǎn)量提高40%例2. 頭孢菌素C生物合成的限速酶 在頭孢菌素C 的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后在得到的發(fā)酵液中，除了主要產(chǎn)物是頭孢菌素

3、C外，在發(fā)酵液中還積累另一種產(chǎn)物-青霉素N。 問題：積累中間產(chǎn)物-青霉素N 原因：下一步反應(yīng)為限速酶反應(yīng) 解決：導(dǎo)入額外的擴環(huán)酶/羥化酶基因 結(jié)果：使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高 25-50%， 積累的青霉素N消失。增加限速酶基因提高頭孢菌素C產(chǎn)量轉(zhuǎn)化C.acremonium394-4 轉(zhuǎn)化后菌株頭孢菌素C產(chǎn)量提高25-50%增加限速酶的其它例子-3:例3. 十一烷基靈菌紅素 產(chǎn)生菌:天藍色鏈霉菌 S.colicolorA3(2)acetyl CoA polyketide pathway 氧甲基轉(zhuǎn)移酶S-腺苷甲硫氨酸構(gòu)建重組質(zhì)粒(帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化到氧甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷變株 轉(zhuǎn)化菌株十一烷基靈菌紅素產(chǎn)量

4、提高5倍增加限速酶的其它例子-4:例4. 泰洛星 (Tylosin) 產(chǎn)生菌:弗氏鏈霉菌 (S.fradiae)acetyl CoA + malonyl CoA polyketide pathway大菌素（macrocin) 甲氧基轉(zhuǎn)移酶 Tylosin構(gòu)建重組質(zhì)粒(帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化到弗氏鏈霉菌 (S.fradiae) 轉(zhuǎn)化菌株泰洛星 (Tylosin) 產(chǎn)量顯著提高2.增加正調(diào)節(jié)基因, 去除負調(diào)節(jié)基因 調(diào)節(jié)基因根據(jù)其作用的不同分為正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)。正調(diào)節(jié)促進生物合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，負調(diào)節(jié)阻扼結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 將帶有正調(diào)節(jié)基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)菌株中，由于轉(zhuǎn)錄功能的增強，使生物合成結(jié)構(gòu)

5、基因得以高水平的表達，提高了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 反之，對于負調(diào)節(jié)基因，通過基因工程的手段，將其祛除或失活，就能解除阻扼作用，同樣導(dǎo)致使生物合成結(jié)構(gòu)基因高水平的表達，提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。調(diào)節(jié)基因在次級代謝產(chǎn)物合成中的作用 次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇內(nèi)的正負調(diào)節(jié)基因 基因 效應(yīng) 菌株 次級代謝產(chǎn)物 功 能 brpA 正 吸水鏈霉菌 Bialaphos 激活bar ( Bialaphos 抗性)基因和 6個bap (生物合成)基因的轉(zhuǎn)錄 tylG 正 弗氏鏈霉菌 泰洛星 激活tyl F( 編碼 MOMT) 和其它 tyl 生物合成基因的表達 actII 正 天藍色鏈霉菌 放線紫紅素 能使act菌株放線

6、紫紅素的產(chǎn) 量增加30 40倍 mmy 負 天藍色鏈霉菌 次甲霉素 該基因的插入失活導(dǎo)致次甲霉 素過量生產(chǎn) strR 正 灰色鏈霉菌 鏈霉素 調(diào)節(jié)鏈霉素的生物合成 . 去除負調(diào)節(jié)基因使結(jié)構(gòu)基因超量表達Methylenomycin（次甲霉素）次甲霉素是由天藍色鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，研究結(jié)果表明，次甲霉素是由天藍色鏈霉菌攜帶的質(zhì)粒SCP I 編碼的。在其生物合成結(jié)構(gòu)基因的上游，存在一個負調(diào)節(jié)基因-mmy。 克隆到質(zhì)粒上 轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌 轉(zhuǎn)化子 （次甲霉素高產(chǎn)表達）mmy3.增加抗性基因的拷貝數(shù) 抗性基因的作用是避免抗生素產(chǎn)生菌被自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所殺滅。其作用可通過三條途徑實現(xiàn)：1.抗性基因產(chǎn)物(酶

7、)將抗生素作用的底物加以修飾; 2.將抗生素的分子結(jié)構(gòu)加以修飾,使其失活; 3.將抗生素分子排出細胞外。 提高菌種耐受自身產(chǎn)生抗生素的能力是取得高產(chǎn)的前提，此外，將胞內(nèi)的抗生素排出胞外，還可以解除高濃度代謝產(chǎn)物對其生物合成的反饋調(diào)節(jié)，使產(chǎn)物大量合成。 將抗生素抗性基因片段連接到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒上，用得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抗生素生產(chǎn)菌株，就可能使抗生素的產(chǎn)量得以提高。 增加抗性基因拷貝提高抗生素的產(chǎn)量例1. Davies J. 利用鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702 從卡那霉素產(chǎn)生菌克隆了6-N-氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6的基因(aacA),該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶A的存在下,可將氨基糖苷類抗生素的氨基糖6乙?；? 將

8、aacA基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉素的產(chǎn)生菌中, 結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量. 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化子- 鏈霉菌細胞 氨基糖苷類抗生素產(chǎn)量提高卡那霉素6-乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC（6） 的作用增加抗性基因拷貝提高抗生素的產(chǎn)量-2例2. 螺旋霉素抗性基因srmB 重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 S.ambofaciens（生二素鏈霉菌） 轉(zhuǎn)化子 使螺旋霉素產(chǎn)量提高。 (二) 改進代謝產(chǎn)物的組分 鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物常常是一組結(jié)構(gòu)相似的混合物。每個化合物稱為它的一個組分。多組分產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是因為次級代謝產(chǎn)物的合成酶對底物的選擇性不強以及合成途徑中分支途徑的存在。 通過基因工程手段，滅活某分支途徑的酶，就可以去除該分之支途徑的產(chǎn)物

9、。此策略常用來去除發(fā)酵產(chǎn)物中的無用組分，提高有用組分的含量。例一: 阿維菌素產(chǎn)生菌的基因改造阿維菌素“B”組分轉(zhuǎn)化成“A”組分的分子基礎(chǔ)阿維菌素“B”組分阿維菌素“A”組分aveDC5-氧甲基轉(zhuǎn)移酶阿維菌素C5位的甲基化 ATP 轉(zhuǎn)甲基酶 aveD“B” 組分“A” 組分OCH3阿維菌素生物合成基因簇1.用基因工程手段滅活C5-氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因主要過程：克隆阿維菌素生物合成的aveD基因構(gòu)建 gene disruption 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化阿維菌素產(chǎn)生菌(S.avermitilis)挑選雙交換菌株陽性菌株的發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)物的組分分析(HPLC, 質(zhì)譜)Disruption plasmid of aveD

10、gene雙交換菌株（阻斷變株）的挑選 發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析D24-1組分的質(zhì)譜分析m/z813M+Na +, D24-1的分子質(zhì)量為790。與107#菌株發(fā)酵液主組分oligmycinA的分子量一致。將兩菌株發(fā)酵液提取物混合后進樣，根據(jù)在HPLC分析中D24-1組分和菌株Ave107#的主峰相重合，可以推測D24-1組分為oligmycinA。2. 只產(chǎn)Avermectin “2”組分基因工程菌的構(gòu)建 aveC 脫水酶阿維菌素“2”組分阿維菌素“1”組分aveC基因在染色體上的位置重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化阿維菌素產(chǎn)生菌tsrR amRtsrR amRGene replacement

11、(基因置換） DBB C am CaveCaveCam tsrR amR aveC+ tsrS amR aveC遺傳型的改變 B amaveCamaveC tsrR amR aveC tsrS amR aveC 傳幾代后，丟掉質(zhì)粒 基因工程菌AveC9基因工程菌AveC-9發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析例二. 黑暗鏈霉菌的基因改造 黑暗鏈霉菌首先是從墨西哥土壤中分離得到的， 1967由美國禮萊公司（Eli Lilly Co.）最初報道了黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物-尼拉霉素復(fù)合物，它包括1、1、2、3、4、5、5、6、7等15個組分。其中組分2、4、5為尼拉霉素的主組分，其他組分為小組分。組分2為安普霉素

12、（Apramycin），組分4為6”-O-氨甲酰卡那霉素B（6”-O-Carbamoylkanamycin B，CKB），組分5為6”-O-氨甲酰托普霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）3 七八十年代，我國中科院微生物所與四川抗生素工業(yè)研究所先后分離到黑暗鏈霉菌的新菌株：黑暗鏈霉菌4107與黑暗鏈霉菌83-1050B8，它們的組分中含有尼拉霉素組分2、4、5。經(jīng)過“七五”攻關(guān)中篩選到了只產(chǎn)組分2（Apramycin）、5 （6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）的菌株U-1359。黑暗鏈霉菌（S.tenebrarius）菌株U-135產(chǎn)生的兩種主

13、要抗生素妥布霉素(Tobramycin) 妥布霉素是氨基糖苷類抗生素，它是黑暗鏈霉菌（S.tenebrarius）產(chǎn)生的尼拉霉素復(fù)合物的組份5 。它對革蘭式陰性菌有很高的抗菌活性。特別是對綠膿桿菌有獨特的抗菌作用，因此常用來治療燒傷后的綠膿桿菌感染。 臨床上使用的妥布霉素是由黑暗鏈霉菌經(jīng)過發(fā)酵后，經(jīng)過樹脂吸附，層析后得到中間產(chǎn)物6”-O-氨甲酰托普霉素，然后再將6”-甲?；獾?，得到妥布霉素。安普霉素(Apramycin) A brief introduction to apramycin 安普霉素是氨基糖苷類抗生素，它是黑暗鏈霉菌（S.tenebrarius）產(chǎn)生的尼拉霉素復(fù)合物的組份2 。它對革蘭式陰性菌和葡萄球菌有很高的抗菌活性。由于分子中具有獨特的辛二糖結(jié)構(gòu)，對多種氨基糖苷類抗生素的耐藥菌仍有抑制和殺滅作用，與常用的氨基糖苷類抗生素不易產(chǎn)生交叉耐藥性。80年代在美國和歐洲安普霉素作為獸用抗生素和飼料添加劑投入市場。我們課題組經(jīng)過九五攻關(guān)，獲得了產(chǎn)生安普霉素單一組分的菌株，并把它開發(fā)成為二類獸用新藥和飼料添加劑。安普霉素/妥布霉素生物合成基因簇的位置 安普霉素生物合成基因簇部分基因妥布霉素生物合成基因簇？ aprA