試驗六感受態(tài)細胞的制備和重組質粒的轉化

1、實驗六感受態(tài)細胞的制備和重組質粒的轉化【實驗目的】.掌握用CaCl2法制備感受態(tài)細胞的原理和方法。.學習和掌握質粒 DNA的轉化和重組質粒的篩選方法?！緦嶒炘怼抠|粒在不同的細菌之間轉移是微生物世界中一種普遍的現(xiàn)象，一個細菌品系通過吸收另一個細菌品系的質粒 DNA而發(fā)生了遺傳性狀的改變，這種現(xiàn)象叫做轉化，獲得了外源DNA的細胞稱為轉化子。在基因克隆技術中，所謂轉化是指質?；蛑亟M質粒被導入受體細胞，表達相應的選擇標記基因，并在一定的培養(yǎng)條件下，在選擇性培養(yǎng)基上長出轉化子的過程。質粒必須通過轉化進入細菌細胞內，才能進行擴增和表達，從而獲得大量的克隆基因，使我們能夠進行進一步的DNA操作，如亞克隆等

2、；或者獲得其表達產物。轉化效率的高低與受體菌的生理狀態(tài)有關。細菌吸收外源 DNA的能力最高時的狀態(tài)被稱為感受態(tài)細胞( competent cell)。有些種類的細菌在其生長的任一階段都處于感受態(tài)，而另一些細菌只有處于某個生長時期時(一般為對數(shù)生長早、中期)，才會處于感受態(tài)，如本實驗所用的大腸桿菌。用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長早中期的細菌可以大大提高細菌吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的能力。對這種現(xiàn)象的一種解釋是CaCl2能使細菌細胞壁的通透性增強，從而提高轉化率。這種轉化方法稱為 化學法”。目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流，在細胞上形成孔洞，使外源 DNA進入胞內，從而實現(xiàn)細胞的

3、轉化。電激轉化的效率往往比化學法高出1至12個數(shù)量級，達到1 x 108轉化子/g DNA甚至1 x 109轉化子/ g DNA所以常用 于文庫構建時的轉化或遺傳篩選。微生物轉化是基因工程的常用技術，大腸桿菌是基因工程中最常用的受體菌，本實驗即是用前面實驗獲得的重組質粒轉化大腸桿菌細胞。【試劑與器材】一試劑. LB液體培養(yǎng)基：參見附錄每組配200mL,其中100mL分裝于500mL三角瓶中，另各取3mL裝于2只大試管中，其余 裝于裝于500mL三角瓶中，121c高壓蒸汽滅菌20分鐘。LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板（1）:配1L LB液體培養(yǎng)基，加入20g瓊脂粉和1支攪拌棒，同上高壓滅

4、菌，趁熱取出置攪拌器上冷卻，待冷至55c左右，加氨茉青霉素（Ampicillin）至終濃度100d g/ml （Amp儲存液一般為100mg/mL）,倒平板，每皿倒約15 mL ,室溫放置過夜至冷凝水揮發(fā)干凈。使用前半小時在 培養(yǎng)基表面加20 dL 50mg/mL X-gal和100dL 0.1mol/L IPTG ,涂勻，待這兩種化合物滲入瓊 脂后，即可用于轉化菌的涂布。每組制備LB平板2個，LB/Amp 平板5個，LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板6個。IPTG儲存液（0.1mol/L）： 1.2g IPTG加水至50ml,過濾除菌，4c儲存。X-gal儲存1夜:50mg/ml溶于二

5、甲基甲酰胺溶劑中，過濾除菌，4c儲存。1 mol/L CaCl2儲存液，使用濃度為 0.1mol/L, CaCl2應使用分析純，配100mL,高壓滅 菌，全班用。甘油（滅菌），全班50mL,同上高壓滅菌。酸洗無菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝，同上高壓滅菌，烘干備用。二器材. 37 c溫箱、水浴鍋、恒溫振蕩器等.高速冷凍離心機.微量移液器等三菌株 大腸桿菌DH& ,基因型為【操作方法】1、感受態(tài)細胞的制備（無菌操作）：1）從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑單個 DH5a大菌落接種到3 mL LB培養(yǎng)液中（2）, 37c劇烈 振蕩（210-240r/min ）培養(yǎng)過夜（3）。2）取1mL過夜培養(yǎng)

6、物，接種到含100mL LB培養(yǎng)液的500 mL錐瓶中，37c劇烈振蕩，直至培養(yǎng)液中細菌濃度達到OD600為0.375-0.4 （4）3）培養(yǎng)物轉入2只50mL離心管中，冰上放置 10分鐘，4,000r/min, 4c離心15分鐘，棄上 清（5）。4）將菌體懸浮于1020mL預冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，冰上放置20分鐘（6）。4,000rpm, 4C,離心10分鐘，棄上清，然后將細菌輕輕懸浮在 2ml 0.1mol/L CaCl2 溶液中 （7）。若不立即進行轉化實驗，則進行第6步操作，反之，則進入轉化操作。6）緩慢滴入甘油（滅菌）至終濃度為15%,輕柔混勻，將細菌分裝成 0.5

7、ml/每管，立即液氮 冷凍，轉入-70C冰箱儲存，可在2個月內使用（8）。2、感受態(tài)細胞的轉化1）設計好實驗項目，如正、負對照（參考如下表格，按表格內容操作）；實臉 騙號轉化項目感受態(tài)細胞Cut）DNACaCl：C IQCmwoL)無菌水總體租（uL）1連接產物十受體菌10C10pL0110完整空載體對照1001 UE wQ101103無DNA對照505554無細胞+空載體對照01 he505355自連載體+受體菌50Q552）從-80C冰箱中取出分裝成 0.5mL/每管的感受態(tài)細胞，置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好 解凍（10）,立即分裝到預冷的1.5mL離心管中，每管體積參見上表，插入冰上待

8、用；3）對轉化管，加入連接產物DNA溶液，輕輕混勻；為保險起見，也可先加入一半的連接產物DNA溶液，輕輕混勻，剩下的一半置-20 C冰箱保存；4）冰上放置30分鐘（11）;5）放入42c水浴中，熱激40秒（12）;6）迅速插入冰上，放置 5分鐘；7）對第1、2項，加入500 dL LB養(yǎng)基，其余加入250 dL LB養(yǎng)基，37c震蕩培養(yǎng)1小時（13）;8）對第1項，各取200 口直接用玻璃珠涂布于 2個LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板上；對第2項, 分別取3、30和100。細菌培 養(yǎng)液，各加無菌水至 150dL （不超過200 口）涂LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（此步驟的目的

9、是計算轉化率）；對其余各項，分別各取一半涂布于LB/ Amp平板上，余下的轉化液置 4c冰箱保存（14）。倒置平板，37c培養(yǎng)12-14小時。一般來說，含有活性半乳糖甘酶的細菌比無活性酶的細菌生長慢，故過夜培養(yǎng)后可見到毫米大小的陽性白色菌落而陰性的蘭色菌落只有針尖大?。?5）。9）挑取白色菌落進行鑒定（見下一個實驗）?！咀⒁馐马椗c提示】（1）倒平板時應避免培養(yǎng)基溫度過高，若溫度過高，則加入的氨茉青霉素會失效，且培養(yǎng)基凝固后表面及皿蓋會形成大量冷凝水，易于造成污染及影響單菌落的形成。若用手掌感受培養(yǎng)基覺得很燙但尚可忍受時，培養(yǎng)基溫度即為55 c左右。制備好的LB/Amp平板可于4 c冰箱儲存2個

10、月，時間過長氨茉青霉素將會失效。加了 IPTG/X-Gal的LB/Amp平板 最好現(xiàn)用。DH&在平板上過夜生長后，可置冰箱中保存一個月左右；接種新鮮的菌落或菌液有利于細菌細胞的同步快速生長，從而使細菌群體在達到一定的OD值后（0.375）大部分細胞都處于感受態(tài)。DH5x的生長需要氧氣，劇烈振蕩的目的是提高培養(yǎng)基的溶氧量以利于細菌的生長(4)達到細菌對數(shù)生長早、中期，需時約2.02.5小時，此步驟至為關鍵，若超過此階段，則轉化效率急劇下降。(5)低溫操作的目的是使細胞不再生長，保持其感受態(tài)。(6)此步驟的目的是洗滌細胞。(7)此時細胞較脆，懸浮時動作要輕，可用移液槍輕輕吸打。-70C冰箱儲存的感

11、受態(tài)細胞在 6-8周后，轉化率很快降低。可用一已知標準及濃度的 閉環(huán)質粒如pUC18/19鑒定感受態(tài)細胞的轉化能力。(9)實驗中一定要設計正負對照，如用無DNA轉化物的感受態(tài)細菌鋪板，若有菌落生長， 說明其中抗生素濃度不夠或感受態(tài)細胞已被污染。加樣時速度要快，但要有條不紊，切勿 加錯！加完樣用槍尖稍攪勻。第1項中所加連接產物的量可根據(jù)連接反應的終體積而定，一般加一半或2/3,其余置20 c保存。(10)從-80 C冰箱中取出冷凍的指管后，也可用雙手搓指管， 利用掌心的溫度解凍。解凍時間勿過長。(11)至少30min ,可延長至1h左右。(12)掌握時間，過長會致死細胞。在許多實驗方案中，熱激時

12、間設為90至120秒，目前已有實驗證明如此長的熱激時間是沒有必要的，且會引起轉化效率的下降。熱激前加入相當于轉化液體積1/10的DMSO可提高轉化效率10倍左右，加入 DMSO后請勿再劇烈振 蕩。(13)此步驟使得細菌恢復正常并讓伊內酰氨酶基因表達。(14)此步驟可在實驗出現(xiàn)錯誤后進行補救。(15)培養(yǎng)時間勿過長，以免衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。很多因素都可以影響轉化的效率，特別需要注意的有兩點，一是制備感受態(tài)細胞時的OD值，二是所用試劑要分析純以上，并用雙蒸水或超純水（如 Mili Q ）配制?！緦嶒灠才拧繉嶒炃皟商焯鬍. coli菌種在LB平板上劃線，37c培養(yǎng)過夜。實驗前一天各組要將試劑準備好，包括

13、培養(yǎng)基的消毒滅菌。下午臨下課時從平板上挑新鮮的單菌落接種到3mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。轉化完畢，次日一早觀察記錄結果，并清理余下的菌種試劑等?！緦嶒瀳蟾嬉笈c思考題】.制備感受態(tài)細胞和轉化時，應特別注意哪些環(huán)節(jié)。.轉化效率的計算：轉化效率是指每微克質粒DNA轉化細胞產生的轉化子數(shù)目，請列表表示你的轉化結果并算出轉化率（列出計算公式）。你所做實驗的轉化效率（正對照）是多少？ 如果過低（如低于104 cfu/ g DNA,請分析可能的原因。需要注意的是，連接產 物的轉化效率是非常低的，為什么？.若實驗出現(xiàn)不正常的結果，請分析原因。附錄：大腸桿菌的高效轉化方法一、試劑TB 溶液：1.512g PIP

14、ES, 1.1025g CaCl2 , 9.31875g KCl ,溶于水，以 5N KOH 調 pH6.7, 再加入5.44225g MnCl2 ,定容至500ml , 0.22 in濾膜過濾滅菌，4c保存。SOB 培養(yǎng)基：Tryptone 20g （OXOID 公司）；Yeast extract 5g （OXOID 公司）；NaCl 0.5g ,加 800ml 雙蒸水，加入250mmol/L KCl 溶液 10ml,用 10mol/L NaOH 調 pH 至7.0,定容至 1,000ml, 高壓滅菌，4c保存；使用前加入5ml經高壓滅菌的2mol/L MgCl2溶液。SOC培養(yǎng)基：含20m

15、mol/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基，SOB培養(yǎng)基高壓滅菌后，降溫至60c或以下時，加入20ml經過濾除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4 c保存。DMSO二、方法（一）感受態(tài)細胞的制備.將 E.coli DH5 ，“涂布于 LB （A-） 培 上，37c過夜。.挑取2-3個直徑2-3mm的大菌落，接種到 50 ml SOB培養(yǎng)基中。在250 ml三角瓶中18C, 200-250rpm振蕩培養(yǎng)，直到 OD=0.6 ,約需要36-48hr。.將三角瓶冰浴10分鐘。.轉移菌液到50 ml離心管。2,500g, 10min , 4C。.菌體用16 ml冰預冷的TB溶液懸浮，冰浴10 min。6.2,500g, 10min, 4 C。.菌體用4ml冰預冷的TB溶液懸浮，加入280ul DMSO。.菌液于冰浴10分鐘后分裝到凍存管。每管 200ul。液氮冷卻，保存于液氮中。大月0分鐘后，轉移到-40 C冰箱保存。（二）轉化.將LB抗性平板，SOC培養(yǎng)基，于37 c預熱。.室溫溶解感受態(tài)細胞。.取200uL菌液加入1.5mL離心管中，放于冰中。.加入1-5uL質粒溶液，用槍頭混勻，冰浴 30min。.42 C熱激30秒，冰浴。.力口入 800uL SOC 培養(yǎng)基，37 C, 250r/min , 1hr。.涂布LB抗性平板，37c過夜。.致敏緩沖液中試劑的純度與濃度對轉化率影響