微生物基本操作講義課件

1、微生物檢測(cè)的基本操作知識(shí)主要內(nèi)容： 1清洗、消毒和滅菌 2顯微操作 3制片和染色 4培養(yǎng)基的制備 5接種、分離純化和菌種保存 6微生物常規(guī)鑒定技術(shù) 1 清洗、消毒和滅菌1. 玻璃器皿的清洗 1.1新購(gòu)的玻璃器皿 浸泡于的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí)，除去游離的堿性物質(zhì)1.2用過的玻璃器皿 污染的器皿，必須經(jīng)過適當(dāng)消毒， 污跡不能洗凈時(shí)，可浸泡于洗液內(nèi)。 1.3洗液的配制 稱取重鉻酸鉀100g與1000mL水置大燒瓶中加熱攪拌溶化，待冷卻后，將燒瓶置冷水中，慢慢加入濃流酸250mL，并不斷攪拌。 消毒滅菌的方法 （一）物理消毒滅菌法（二）化學(xué)消毒法 （一）物理消毒滅菌法1.熱力滅菌法 熱力滅菌法分干熱滅菌和

2、濕熱滅菌兩大類。在同一溫度下， 后者效力比前者為大，這是因?yàn)椋?（1）濕熱中細(xì)菌菌體蛋白較易凝固；（2）濕熱的穿透力比干熱大；（3）濕熱的蒸汽有潛熱存在。水由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)釋放出的潛熱，可迅速提高被滅菌物體的溫度。 加熱滅菌和加熱消毒的方法： 干熱滅菌法 火焰滅菌法 干燥加熱空氣滅菌法高溫滅菌 巴氏消毒法 常壓下 煮沸消毒法 濕熱滅菌法 間歇滅菌法 常規(guī)加壓滅菌法 加壓下 (高壓蒸汽滅菌法) 連續(xù)加壓滅菌法干熱滅菌法1.焚燒：是一種徹底的滅菌方法，但僅適用于廢棄物品或尸體等。2.燒灼：直接用火焰滅菌，適用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的接種環(huán)、試管口等的滅菌（圖3-2）。3.干烤：用烤箱滅菌。一般加熱至16

3、0170經(jīng)2小時(shí)。適用于高溫下不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品， 如玻璃器皿、瓷器等。 濕熱滅菌法1.煮沸法：1個(gè)大氣壓下，煮沸的水溫為100，一般細(xì)菌繁殖體煮沸5分鐘即被殺死。細(xì)菌芽胞常 需煮沸1小時(shí)，才被殺死。水中加入 2%碳酸鈉，既可提高沸點(diǎn)達(dá)105，促進(jìn)細(xì)菌芽胞的殺滅，又 可防止金屬器皿生銹。 2.巴氏消毒法（pasteurization）:用較低溫度殺滅液體中的病原菌、同時(shí)又不影響消毒物品的營(yíng) 養(yǎng)成分及香味的消毒方法。加熱61.162.8半小時(shí)即可，常用于牛奶和酒類等的消毒。 3. 間歇滅菌法（fractional sterilization）:將待滅菌的物品100 加熱1530分 鐘，殺死其中

4、的細(xì)菌繁殖體，然后將物品置于37溫箱中過夜使芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再通過流通蒸 汽加熱，如此連續(xù)三次，可將所有細(xì)菌繁殖體和芽胞全部殺死。 4.高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌方法。方法是在一密閉蒸鍋高壓蒸汽 滅菌器內(nèi)進(jìn)行的。通常 在1.05kg/cm2的壓力下，溫度達(dá)121.3,維持1530分鐘，可殺死包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。 此法適用于耐高溫和不怕潮濕物品的滅菌。2.紫外線與射線滅菌法1.紫外線：紫外線波長(zhǎng)為240280nm時(shí)具有殺菌作用，其中 以260nm最強(qiáng)。紫外線殺菌機(jī)理主要是作用于細(xì)菌DNA，使同一條DNA 鏈上相鄰的兩個(gè)胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合而形成嘧啶二聚體，因而

5、改變DNA的分子構(gòu)型，干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制與 轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡或變異。紫外線穿透力差，故只適用于空氣及不耐熱物品的表面消毒。 2.電離輻射：高速電子、X 射線和射線等在足夠劑量時(shí)，對(duì)各種細(xì)菌均有致死作用。其機(jī)制在于 產(chǎn)生游離基，破壞細(xì)菌DNA。電離輻射常用于大量一次性醫(yī)用塑料制品的消毒。 3.濾過除菌濾過除菌是用物理阻留的方法將液體或空氣中的細(xì)菌除去，以達(dá)到無(wú)菌的目的。所用的器具是濾菌器（filter）。濾過除菌主要用于一些不耐高溫滅菌的血清、細(xì)菌毒素、抗生素，以及空氣等的除菌。濾菌器的種類很多，目前常用的有濾膜濾菌器、石棉濾菌器（亦稱Seitz濾菌 器）、玻璃濾菌器等。 （二）化學(xué)消毒法

6、用化學(xué)藥品進(jìn)行消毒的方法，由于化學(xué)藥品對(duì)細(xì)菌及人體都有毒性，故只能用于體表、醫(yī)療器械及周圍環(huán)境等的消毒。 殺菌機(jī)制：（1）使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固；（2）干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)和代謝；（3）影響細(xì)菌胞漿膜的通透性。 消毒劑類別名稱濃度(%)用途重金屬鹽紅汞2皮膚、粘膜、小創(chuàng)面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化劑高錳酸鉀0.1皮膚、尿道、水果、蔬菜消毒過氧化氫3皮膚、粘膜、創(chuàng)傷消毒過氧乙酸0.20.5塑料、玻璃、人造纖維消毒鹵素類碘液2.5皮膚消毒醇類乙醇7075皮膚、體溫計(jì)消毒酚類石炭酸35地面、器皿表面和排泄物消毒來(lái)蘇35同上、也常用于手及皮膚消毒表面活性劑新潔爾滅0.1手術(shù)器械消毒酸堿類生石灰1:

7、41:8排泄物、地面消毒染料龍膽紫24表淺創(chuàng)傷消毒影響消毒滅菌效果的因素 1.消毒劑的性質(zhì)、濃度和作用時(shí)間：一般情況下濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺菌效果越好。但95%的 乙醇消毒效果反不如75%為好，因?yàn)楦邼舛纫掖际辜?xì)菌表面的蛋白質(zhì)迅速脫水而凝固，影響乙醇進(jìn)入菌體內(nèi)，減弱其殺菌作用。 2.微生物的種類與數(shù)量：同種消毒劑對(duì)不同微生物的殺菌效果不同。如結(jié)核桿菌對(duì)酸、堿的抵抗力 比其他的菌強(qiáng)；70%乙醇可殺死一般細(xì)菌繁殖體，但不能殺滅細(xì)菌芽胞。因此，必須根據(jù)消毒對(duì)象選擇合適的消毒劑。3.環(huán)境中有機(jī)物的影響：消毒環(huán)境中如有有機(jī)物存在，如血清、膿汁、痰、糞便等，可與消毒劑結(jié)合而影響殺菌效果。 2顯微操作顯

8、微鏡是微生物檢驗(yàn)中最常用的精密光學(xué)儀器。顯微鏡的種類很多，在實(shí)驗(yàn)室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗(yàn)中最常用的是普通光學(xué)顯微鏡。 普通顯微鏡的使用方法 1低倍鏡觀察 2高倍鏡觀察 3油浸鏡觀察 使用油浸鏡時(shí)，鏡臺(tái)要保持水平，防止油流動(dòng)，油浸鏡所用的油要潔凈。 普通顯微鏡的保養(yǎng) (1)觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。(2)用過油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭23次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。(3)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。(4)將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)器的位置，罩上防塵套。鏡頭

9、清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡紙 ，物鏡的清洗，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。 染色方法(一)簡(jiǎn)單染色法 簡(jiǎn)單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細(xì)菌染上顏色，觀察細(xì)菌的形態(tài)。(二)復(fù)染色法 用兩種或多種染料染細(xì)菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細(xì)菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。 革蘭氏染色法：不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)，而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。實(shí)驗(yàn)材料1.

10、顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈等。2.石炭酸復(fù)紅染液、草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95乙醇、蕃紅染液3.菌種實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟(一)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色步驟 涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢1涂片 取干凈的載玻片于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片的中央滴一滴無(wú)菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量培養(yǎng)物與玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大。2干燥 涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。 3固定 手持載玻片

11、的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來(lái)回通過23次，共約23秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60）,放置待冷后，進(jìn)行染色。4染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍(lán)任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5水洗 斜置載玻片，在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無(wú)色為止。6干燥 用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。 7鏡檢(二)細(xì)菌的革蘭氏染色步驟 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脫色水洗復(fù)染水洗干燥觀察1取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡(jiǎn)單染色的相同。2用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗

12、。3加碘液媒染1min后水洗。4斜置載玻片，滴加95乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色 為止，大約需時(shí)2030s，隨即水洗。5用蕃紅染液復(fù)染1min，水洗。6用吸水紙吸掉水滴，待標(biāo)本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色。革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑 步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上 步驟2：用無(wú)菌操作法取少許培養(yǎng)物于蒸餾水滴上 步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層 步驟4：風(fēng)干 步驟5：在酒精燈火焰外層盡快的來(lái)回通過3-4次固定步驟6：結(jié)晶紫染色1分鐘 步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片 步驟8：革蘭氏碘液染色1分鐘，再用蒸餾水輕輕沖洗 步驟9：酒精

13、脫色至下滴液為無(wú)色，立即用蒸餾水沖洗 步驟10：番紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗 大腸桿菌（Escherichia coli）革蘭氏染色圖 革蘭氏染色陰性桿菌（紅色） 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）革蘭氏染色 革蘭氏染色陽(yáng)性球菌（紫色） 注意事項(xiàng)1革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽(yáng)性菌。因此必須 嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。2 選用培養(yǎng)18-24小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。4.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng) 4.1培養(yǎng)

14、基配方的選定同一種培養(yǎng)基的配方在不同資料中常會(huì)有某些差別。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外，一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對(duì)，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來(lái)源。 4.2培養(yǎng)基的制備記錄每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來(lái)源，和各種成份的牌號(hào)，最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。 4.3培養(yǎng)基成分的稱取培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方上做出記號(hào)，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左

15、側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。 4.4培養(yǎng)基各成份的混合和溶化使用不銹鋼鍋或大燒杯等加熱溶化，不能用銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長(zhǎng)。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)攪動(dòng)、以防焦化，如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，直至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。 4.5培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會(huì)有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如

16、，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。因此，對(duì)這個(gè)步驟，操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。 4.6培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基必須絕對(duì)澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無(wú)顯著沉淀，必要時(shí)，采用過濾或其它澄清方法。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。4.7培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝分裝于試

17、管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2/3在試管內(nèi)，1/3在試管外。其外還須用防水紙包扎。（目前試管一般多有用螺旋蓋，采用金屬或塑料試管帽）。分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí)，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，作為測(cè)定該批培養(yǎng)基最終pH之用。4.8培養(yǎng)

18、基的滅菌一般培養(yǎng)基可采用121C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無(wú)特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無(wú)菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無(wú)菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50C左右的培養(yǎng)基中。 4.9培養(yǎng)基斜面和平板的制作 瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55-60時(shí)，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。斜面長(zhǎng)度不超過試管長(zhǎng)度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。制作平板培養(yǎng)基時(shí)，將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基

19、融化后，待冷至50左右傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50，培養(yǎng)基易于凝固而無(wú)法制作平板。平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，右手拿錐形瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入1012mL的培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。4.10培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試 每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測(cè)定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入361C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，即棄去。用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1

20、2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時(shí)，如無(wú)菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。4.11培養(yǎng)基的保存培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁(yè)或明顯標(biāo)簽。 5接種、分離純化培養(yǎng)和菌種保存 5.1接種將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。 5.1.1接種工具和方法 1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 圖5-1接種和分離工具常用的接種方法有以下幾種：(1)劃線接種 最常用

21、，工具：接種環(huán)，接種針，在斜面接種和平板劃線中就常用此法。(2)三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。(3)穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線周圍能夠生長(zhǎng)。(4)澆混接種(5)涂布接種(6)液體接種 固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)物液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)物固體培養(yǎng)基。(7)注射接種 疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預(yù)防某些疾病。(8)活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法

22、，接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。5.1.2無(wú)菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。接種時(shí)，打開培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來(lái)回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來(lái)挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖5-2）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種

23、環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。圖5-2斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作 (1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞 5.2分離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。 5.2.1傾注平板法

24、首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在4050左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。 圖1傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解 1.菌懸液 2.熔化的培養(yǎng)基 3.培養(yǎng)物 4.無(wú)菌水 稀釋倒平板和涂布法5.2.2涂布平板法首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無(wú)菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無(wú)菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。（圖1 b） 5.2.3平板

25、劃線法最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖2）當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散生長(zhǎng)，各自形成菌落，以便根據(jù)菌落形態(tài)及特征，挑選單個(gè)菌落，經(jīng)過移種而獲得純種細(xì)菌 (純培養(yǎng))。 圖2平板劃線分離法 1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 劃線接種示意圖5.2.4富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，使其能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超

26、過其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落。5.2.5厭氧法為了分離某些厭氧菌，利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。 5.3培養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)，除了受本身的遺傳特性決

27、定外，還受到許多外界因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。 5.3.1影響微生物生長(zhǎng)的因素 一)營(yíng)養(yǎng)物濃度 二)溫度 根據(jù)微生物最適生長(zhǎng)溫度的不同，可將它們分為三個(gè)類型：(1)嗜冷微生物：其是適生長(zhǎng)溫度多數(shù)在-1020之間(2)中溫微生物：其最適生長(zhǎng)溫度一般在2045之間 (3)嗜熱微生物：生長(zhǎng)溫度在45以上。 三）水分 四）氧氣 (1)需氧微生物 (2)兼性需氧微生物 (3)微量需氧微生物 (4)耐氧微生物 (5)厭氧微生物 5.3.2培養(yǎng)方法 根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為：好氧培養(yǎng)；厭氧培養(yǎng)。一）好氧菌的培養(yǎng)(1)固體表面培養(yǎng)法 (

28、2)液體培養(yǎng)法 二)厭氧菌的培養(yǎng) (1)深層穿刺培養(yǎng)(2)化學(xué)吸氧與深層穿刺相結(jié)合 (3)抽氣法 5.4菌種保存 菌種保藏方法很多，但主要是根據(jù)以下原則而設(shè)計(jì)的：(1)必須選用典型優(yōu)良純培養(yǎng)物進(jìn)行保藏，并盡量采用其休眠體，如細(xì)菌物芽孢，真菌的孢子等進(jìn)行保藏；(2)創(chuàng)造有利于微生物休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等；(3)盡量減少傳代次數(shù)。采用以上措施有利于達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。 (1)低溫保存 45左右的凍箱中貯存。一般細(xì)菌可保存13個(gè)月、酵母菌和霉菌可保存26個(gè)月后，再移種到新配的斜面培養(yǎng)基1次，經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，再行保藏。 優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，不需特殊設(shè)備；缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短

29、，菌種經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接后，遺傳性狀易發(fā)生變異，生理活性減退。 斜面保藏法 將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C冰箱中包藏。 保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存24個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。 此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。穿刺保藏法 按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4冰箱存放。礦物油保存 菌種在瓊脂斜面上或在半固體瓊脂試管中生長(zhǎng)后，在試管中再加入無(wú)菌液體石蠟，覆蓋在培養(yǎng)基上面，這樣就會(huì)使菌種和培養(yǎng)基與外界空氣隔離，并可防止培養(yǎng)基

30、水分蒸發(fā)，管口可用固體石蠟封口，放置低溫保存，至少保存6個(gè)月至1年。此法適于保藏霉菌、酵母菌和放線菌。但有些細(xì)菌和霉菌如固氮菌、乳桿菌、分枝桿菌和毛霉、根霉等不宜用此法保存。 6微生物常規(guī)鑒定技術(shù) 6.1形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 6.1.1微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。 6.1.2微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 (1)細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌

31、落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。（圖6-1） (2)霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。6.2生理生化試驗(yàn)6.2.1適應(yīng)環(huán)境特性試驗(yàn)6.2.1.1生長(zhǎng)溫度的試驗(yàn)微生物在一定的溫度范圍內(nèi)能進(jìn)行其生命活動(dòng)。如超出適宜溫度的范圍，便會(huì)產(chǎn)生不利影響，各種不同的微生物所需的最適溫度各不相同。因此，一定要掌握好微生物的最適溫度。一般病原菌的最適溫度是37，但在1045范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)。 6.2.1.2生長(zhǎng)pH試驗(yàn)pH對(duì)微生物發(fā)育影響很大。有的細(xì)菌能耐酸如乳酸桿菌等；有的細(xì)菌能耐堿，如霍亂弧菌在pH9.2能生長(zhǎng)