不同程度低血壓對(duì)頸動(dòng)脈中度狹窄家兔海馬CA1區(qū)凋亡蛋白的影響

1、不同程度低血壓對(duì)頸動(dòng)脈中度狹窄家兔海馬 CA1 區(qū)凋亡蛋白的影響張 鵬 薛朝霞 王春燕 方愛莉 楊春艷 孟永生師瑾山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，山西太原030001 摘要 目的 觀察不同程度低血壓對(duì)雙側(cè)頸動(dòng)脈中度狹窄家兔海馬CA1區(qū)Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，結(jié)合其行為學(xué)表現(xiàn)探討低血壓對(duì)其腦組織的損傷作用。 方法 選擇健康雄性家兔 24 只， 完全隨機(jī)法分為 6 組，每組 4 只，除了 K 組（空白對(duì)照組）外，其余20 只在成功建立雙側(cè)頸動(dòng)脈中度狹窄模型24h 后，將其隨機(jī)分為 D組（單純狹窄組）、X1組（硝酸甘油1組）、X2組（硝酸甘油2組） 和B1組（丙泊酚1組）、

2、B2組（丙泊酚2組），XI、X2組和B1、B2 組通過硝酸甘油、丙泊酚分別降低基礎(chǔ)血壓的10%- 15聽H 15%-20% 使血壓波動(dòng)于基礎(chǔ)血壓的 85%-90騎口 80%-85迄間，維持30 min后補(bǔ)足容量恢復(fù)基礎(chǔ)血壓，繼續(xù)喂養(yǎng)48 ho 72 h將所有家兔斷頭取腦，做免疫組織化學(xué)染色圖片，并利用 IPP6.0 圖像分析軟件測(cè)定其海馬CA1區(qū)Caspase-3、Bcl-2、Bax的積分光密度值（IOD值）。各組家兔于T1 （建立模型前，0h）、T2 （建立本II型后24 h開始降壓前，24 h） 及T3 （恢復(fù)基石血壓后48h開始斷頭前，72h）,通過精神狀態(tài)、反 應(yīng)程度、 四肢肌力及飲水

3、攝食情況等方面觀察其行為學(xué)表現(xiàn)。 結(jié)果 通 過IOD值測(cè)量可得：與K組相比，D X1、B1、X2、B2組陽性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）;與D組相比，X1、B1、X2、B2組陽 性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）;與X1組相比，D1組陽性表達(dá) 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，X2、B2組陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）;與B1組相比，X2、B2組陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）;與X2組相比，B2組陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。各組家兔 在T1、T2行為學(xué)改變不明顯；T3時(shí)，K組家兔行為學(xué)觀察同T1時(shí)，D組家兔精神恢復(fù)正常，XI、B1組家兔則出現(xiàn)精神稍顯萎靡、反應(yīng)稍顯遲

4、鈍、四肢肌力減退、活動(dòng)減少、飲水、攝食活動(dòng)下降， B2 組家兔出現(xiàn)精神萎靡、飲水、攝食減少等表現(xiàn)，而X2 組家兔甚至出現(xiàn)嗜睡、進(jìn)食、飲水很少等表現(xiàn)。結(jié)論 降低雙側(cè)頸動(dòng)脈中度狹窄家兔基礎(chǔ)血壓10%-20%|致Caspase-3、Bax陽性表達(dá)增高、Bcl-2陽性表達(dá)減少， 結(jié)合其行為學(xué)表現(xiàn)說明其出現(xiàn)早期腦損傷。 其中降低基礎(chǔ)血壓15%-20例組中，丙泊酚對(duì)腦組織損傷較輕，可能與其腦保護(hù)作 用有關(guān)。 關(guān)鍵詞 頸動(dòng)脈狹窄； 低血壓； 凋亡； Caspase-3 ； Bcl-2 ； Bax 中圖分類號(hào) R743 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1672-5654（2021） 05（b） -0113-02隨著

5、社會(huì)老齡化、 以及外科和麻醉水平的提高， 越來越多頸動(dòng)脈狹窄患者接受手術(shù)治療， 國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)此類病人易發(fā)生術(shù)后認(rèn)知功能障礙（POCD1 , POC醫(yī)患者出現(xiàn)早期腦損傷的常見臨床表現(xiàn)，但現(xiàn)有研究表明： 圍術(shù)期降低血壓程度、 降低血壓持續(xù)時(shí)間與早期腦損傷的關(guān)系尚無定論。本實(shí)驗(yàn)從2021 年 3 月 2021 年 7 月，通過觀察不同程度低血壓對(duì)雙側(cè)頸動(dòng)脈中度狹窄家兔海馬 CA1 區(qū) Caspase-3 、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響及T1、T2、T3行為學(xué)改變，旨在對(duì)腦血流動(dòng)力學(xué)變化與腦損傷的相關(guān)性作初步探討， 為圍術(shù)期此類病人的麻醉管理提供參考依據(jù)。資料與方法主要試劑和儀器Caspase-3

6、多克隆抗體（ 1:100 ） 、 Bcl-2 多克隆抗體（ 1:100 ） 、 Bax多克隆抗體（1:100）、HR刖記的抗鼠IgG （1:100）;硝酸甘油注射液，丙泊酚注射液，RM6240系列多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，光學(xué)顯微鏡。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性新西蘭白兔24只，月齡24個(gè)月，體重2.02.5kg,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物模型建立用速眠新II注射液合劑0.1 mL/kg將家兔麻醉后，仰臥位固定，備皮、鋪單后取頸正中切口，小心分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，在環(huán)狀軟骨下 1cm用縫線與0.9 mm塑料管結(jié)扎兩道，小心抽出塑料管，調(diào)整縫線間距為2 mm,形成狹窄處內(nèi)徑等于塑料管的外徑。建立模型前

7、后分別由兩名超聲科醫(yī)生測(cè)量頸動(dòng)脈內(nèi)徑，其結(jié)果符合2021 北美放射年會(huì)超聲會(huì)議公布的超聲多普勒判定頸動(dòng)脈中度狹窄的標(biāo)準(zhǔn) 2 ，確定模型的成功制備。動(dòng)物分組和干預(yù)24只家兔隨機(jī)分為6組，每組4只，除了 K組（空白對(duì)照組）外，其余20只在成功建立模型24 h后，將其隨機(jī)分為D組（空白對(duì)照組）、X1 組（硝酸甘油 1 組） 、 X2 組（硝酸甘油 2 組）和 B1 組（丙泊酚1組）、B2組（丙泊酚2組），D組不做降壓處理，X1組、X2組和B1組、 B2組分別用硝酸甘油、丙泊酚分別降低基礎(chǔ)血壓10%-15% 15%-20% 使血壓波動(dòng)于基礎(chǔ)血壓的 85%-90% 80%-85迄間，維持30 min后

8、補(bǔ)足容量恢復(fù)基礎(chǔ)血壓，繼續(xù)喂養(yǎng)48 h。 6組家兔于開始降壓時(shí)行股動(dòng)脈插管后鏈接壓力換能器，并連接于RM624夠道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)各組家兔的血壓變化情況。免疫組化染色各組動(dòng)物于 72 h 后，在深度麻醉下，依次以0.9%的溫生理鹽水、4%多聚甲醛緩沖液經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注后取出腦組織，將全部腦組織置于4%多聚甲醛緩沖液中24 h 后進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、透明，石蠟包埋后由視交叉開始連續(xù)冠狀切片（6小力，置于60c溫箱中烤片。根據(jù)抗原抗體原理及DAB顯色制備海馬組織切片。海馬CA1區(qū)棕色顆 粒沉著為陽性細(xì)胞， 并用 IPP6.0 圖像分析軟件檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2 、Bax

9、的積分光密度值（IOD）作為凋亡蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。行為學(xué)觀察所有動(dòng)物于T1 （建立模型時(shí)，0h）、T2 （建立模型后24 h開始降壓 前，24 h）、T3 （恢復(fù)基石血壓后48 h, 72 h）通過精神狀態(tài)、反應(yīng) 程度（對(duì)疼痛刺激的反應(yīng)） 、四肢肌力（四肢牽拉時(shí)的回縮力度）及飲水?dāng)z食情況等方面觀察其行為學(xué)表現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 spss 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，多 個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 兩兩比較采用 LSD-t 檢驗(yàn)。 檢 驗(yàn)水準(zhǔn) =0.05, P 0.05）,表1。免疫組化染色結(jié)果免疫組化染色圖片IOD值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：與K組相比，D XI、B1、 X2、

10、B2組陽性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）;與D組相比， XI、B1、X2、B2組陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）;與X1組 相比，B1組陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，X2、B2組陽性表達(dá)差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）;與B1組相比，X2、B2組陽性表達(dá)差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（P0.05）;與X2組相比，B2組陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P 0.05）,表 2。行為學(xué)觀察結(jié)果K、D XI、B1、X2、B2各組家兔在T1表現(xiàn)為：精神狀態(tài)良好、針刺時(shí)躲避時(shí)間短、牽拉四肢時(shí)，四肢回縮有力，飲水?dāng)z食活動(dòng)正常；T2時(shí)，K組家兔行為學(xué)觀察同T1時(shí)，D XI、B1、X2、B2組家兔除 精神稍顯萎靡

11、外其余觀察同 T1表現(xiàn)；T3時(shí)，K組家兔行為學(xué)觀察同 T1時(shí)，D組家兔精神恢復(fù)正常，XI、B1組家兔則出現(xiàn)精神稍顯萎靡、 反應(yīng)稍顯遲鈍、四肢肌力減退、活動(dòng)減少、飲水、攝食活動(dòng)下降， B2 組家兔出現(xiàn)精神萎靡、飲水、攝食減少等表現(xiàn)，而 X2 組家兔甚至出現(xiàn)嗜睡、進(jìn)食、飲水很少等表現(xiàn)。表3討論大腦80%的血供來自頸動(dòng)脈，頸動(dòng)脈狹窄造成前循環(huán)障礙，加之圍手術(shù)期麻醉藥物和控制性降壓導(dǎo)致的低血壓會(huì)加重前循環(huán)障礙， 而皮質(zhì)高級(jí)功能依賴頸動(dòng)脈系統(tǒng)的正常血液供應(yīng)， 所以前循環(huán)障礙是導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知損害（POCD的主要原因。本實(shí)驗(yàn)在建立頸動(dòng)脈狹窄模型后，使用麻醉藥、擴(kuò)血管藥物降低其血壓，觀察家兔海馬CA1區(qū)凋亡蛋白

12、和其行為學(xué)改變來評(píng)估頸動(dòng)脈狹窄患者圍手術(shù)期發(fā)生早期腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)。神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧耐受力差，如果缺血程度輕、持續(xù)時(shí)間短則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞對(duì)缺血特別敏感并且其表達(dá)高峰發(fā)生在損傷后的4872h3,故本實(shí)驗(yàn)觀察72h海馬CA1區(qū)凋亡蛋白。細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2 家族起著至關(guān)重要的作用，其中Bcl-2可以阻止細(xì)胞凋亡，而Bax 則可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且近期研究發(fā)現(xiàn)：Bcl-2 和 Bax 除與自身表達(dá)的高低外，還與Bcl-2/Bax 的比率有關(guān)，當(dāng)比率降低時(shí)細(xì)胞趨于死亡4 。通過測(cè)量發(fā)現(xiàn)，隨著低血壓程度的增力口，Bcl-2的IOD值逐漸降低，Bax的IOD值逐漸升高，且Bcl-2

13、/Bax比值逐漸降低，客觀驗(yàn)證了腦損傷的加重。Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶， 也是細(xì)胞凋亡的終末剪切酶5 ， 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， Caspase-3 在正常海馬中幾乎不表達(dá)，隨著低血壓程度的增加，IOD值逐漸增高，也客觀說明了腦損傷的加重。如果家兔發(fā)生早期腦損傷， 加之代償時(shí)間較短， 可出現(xiàn)一定程度的神經(jīng)行為學(xué)改變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T1、 T2 各組家兔行為改變不明顯；T3時(shí)，K組與D組家兔的行為表現(xiàn)差別不大，而 XI、X2、B1、B2組 家兔表現(xiàn)出比K、 D 組家兔明顯的神經(jīng)損傷行為，說明單純頸動(dòng)脈狹窄家兔相對(duì)于正常家兔沒有造成明顯的神經(jīng)損傷， 而降低其基礎(chǔ)血壓造成了

14、明顯的神經(jīng)損傷， 從而客觀說明嚴(yán)格控制降壓程度對(duì)于頸動(dòng)脈狹窄患者的重要意義。近年來， 大量動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)都說明了丙泊酚的腦保護(hù)效應(yīng)， 其腦保護(hù)可能與阻滯鈣通道、清除自由基、抑制釋放甘氨酸以及激活Y-氨基丁酸受體6等有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，X2組與B2組在相同降壓程度、 相同降壓時(shí)間的情況下，與 X2組相比，B2組家兔在凋亡蛋白表達(dá)及 行為學(xué)方面都表現(xiàn)出腦損傷的減輕， 也客觀說明了丙泊酚的腦保護(hù)作 用。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎法制備頸動(dòng)脈狹窄模型， 造模24h后發(fā)現(xiàn)與K組相 比，D組家兔Caspase-3、Bax的IOD值升高，Bcl-2的IOD值降低， 其原因可能為缺少代償時(shí)間， 從而人為上加重家兔腦組織的損傷

15、作用；XI、B1組與D組相比，三者IOD值及行為學(xué)表現(xiàn)有不同程度的改變，其也可能與缺少代償時(shí)間有關(guān)， 從而提示代償時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)腦損傷的重要意義。綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)在成功建立家兔雙側(cè)頸動(dòng)脈中度狹窄模型的基礎(chǔ)上，用不同藥物降低基礎(chǔ)血壓，通過測(cè)量海馬CA1區(qū)免疫組化染色圖 片IOD值、觀察家兔行為學(xué)改變，說明，雙側(cè)頸動(dòng)脈中度狹窄家兔在 降低基礎(chǔ)血壓10%- 20%寸，出現(xiàn)早期腦損傷，且隨著低血壓程度的加重，腦損傷也相應(yīng)加重，與本課題組中血清S100B和NSE的濃度變化的結(jié)果有很好的呼應(yīng)。但X1組和B1組在海馬CA1區(qū)免疫組化染 色圖片IOD值的測(cè)量上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本例數(shù)少或早期 腦損傷程度較輕有關(guān)， 尚需進(jìn)一步探討。 本課題組的相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)也在進(jìn)行中。 參考文獻(xiàn) 向靜 , 張濤 , 周華東 . 老年頸動(dòng)脈狹窄與認(rèn)知功能障礙的相關(guān)研究 J. 中華臨床醫(yī)師雜志 , 2021, 5(6): 1575-1578.趙穎 , 譚澤鋒 , 徐安定 . 歐洲血管外科學(xué)會(huì)指南： 第二部分頸動(dòng)脈 狹 窄 患 者 的 診 斷 和 檢 查 J. 國 際 腦 血 管 病 雜 志 , 2021,19(7):488-497.張學(xué)軍 , 任光陽 , 劉濤 . 腦出血家兔模型血腫周圍腦組織細(xì)胞凋 亡 與 c-fos 表 達(dá) 水 平 的 關(guān) 系 J. 中 國