ELISA法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)的操作步驟

1、ELISA法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)的操作步驟摘要：ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。找產(chǎn)品，上生物幫一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、深入了解ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)的原理。2、掌握ELISA法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)的方法。間接ELISA效價(jià)圖二、實(shí)驗(yàn)原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技

2、術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA法是免疫酶技術(shù)的一種，其特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進(jìn)行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系，也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中。酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次，即可用二抗（抗抗體）、三抗再次進(jìn)行免疫反應(yīng)。目前常用的幾種ELISA方法有：測(cè)定抗體的間接法，測(cè)定抗原的雙抗體夾心法和測(cè)定抗

3、原的競(jìng)爭(zhēng)法等。本實(shí)驗(yàn)采用間接法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)。其主要過程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi)，加待測(cè)抗體，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，加酶標(biāo)抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應(yīng)，用目測(cè)或光電比色測(cè)定抗體含量。三、儀器、原料和試劑儀器聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。原料單克隆抗體試劑1、抗原及酶標(biāo)記抗體抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanlgG,CodeNo.A0423);酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouselgG-HRP,CodeNo.P0260);均為DAKO公司產(chǎn)

4、品，使用時(shí)按照說明書要求稀釋。4、洗滌液(含0.05%Tween20的PBS):1LPBS中加入Tween-20500L.5、封閉液(含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween20的PBS):lOmLPBS中加入lOOmgBSA,10LTween-20.6、底物溶液磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0):稱Na2HP0412H2O2.2g,NaH2P042H206.84g,用蒸餾水溶解，定容至500mL.TMB貯液：稱60mgTMB溶于10mL二甲基亞砜中,4C避光保存。底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL,TNB貯液10pL.30%H2O215pL,混勻。7、終止液：2mol/LH2

5、SO4四、操作步驟抗原包被：兔抗人IgG作為抗原，用包被液1：8000稀釋，100卩L/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中4C放置過夜。洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。封閉：加100pL/孔封閉液，室溫放置0.5h.洗滌：用洗滌液洗3次。加待測(cè)樣品（一抗）:將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS連續(xù)稀釋（按照1：2或1：10）,100L/孔加到已包被的板上，每個(gè)樣品平行做兩份，PBS或空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。加蓋37C恒溫箱溫育12h.洗滌：用洗滌液洗3次。加酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP,用封閉液1：8000稀釋，100L/孔，加蓋37C恒溫箱溫育1h。洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。顯色：加新鮮配制的底物溶液100L/孔