奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的體外作用

1、奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的體外作用【摘要】【目的】研究奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的生長抑制作用及對aspase-3活性的影響?！痉椒ā坑萌藢m頸癌HeLa細(xì)胞株經(jīng)奧沙利鉑處理后，TT法測定細(xì)胞生長抑制率,透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞儀和原位末端標(biāo)記技術(shù)法TUNEL檢測細(xì)胞凋亡率，比色法檢測aspase-3活性變化，,并利用A-DEVD-H進(jìn)展aspase-3抑制試驗(yàn)?！窘Y(jié)果】奧沙利鉑(464l/L)在體外能以時(shí)間和劑量依賴的方式對宮頸癌HeLa細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用并誘導(dǎo)其凋亡，奧沙利鉑作用細(xì)胞株48h后,細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征；并能增加HeLa細(xì)胞的aspase-3

2、活性，A-DEVD-乙醛(A-DEVD-H)可有效抑制奧沙利鉑誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡?！窘Y(jié)論】奧沙利鉑在體外能抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，aspase-3活化參與了奧沙利鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡過程。【關(guān)鍵詞】宮頸癌；奧沙利鉑；生長抑制；aspase-3Abstrat：【bjetive】Tstudytheeffetfxaliplatinngrthinhibitinandaspase-3ativitynhuanervialanerHeLaells.【ethds】HuanervialarinaHeLaellseretreatedithxaliplatin.ellgrthratea

3、sdeterinedithTTassay;ellrphlgihangesereexainedundereletrnirspy.FlytetryandTUNELasusedtexaineellapptsisrate.Ativitiesfaspase-3eredeterinedbyhretry,anditsinhibitinastestbyA-DEVD-H.【Results】xaliplatin(4-64l/L)induedyttxiityandapptsisthuanervialarinaHeLaellsinvitristie-dependentanddse-dependent.Thetypia

4、lappttirphlgialfeaturesappearedintheellstreatedithxaliplatinfr48hurs;aspase-3ativityasup-regulatedinxaliplatin-induedappttiells.ThexaliplatininduedHeLaellapptsisaseffiientlyinhibitedbyA-DEVD-H.【nlusin】xaliplatinaninhibitHeLaellgrthfervialarinaandindueapptsisinvitr.aspase3ativatinaybeinvlvedinxalipla

5、tin-induedapptsisfHeLaells.Keyrds：ervialarina;xaliplatin;ellgrth;aspase-3JSUNYat-senUniv(edSi),2022,28(5):485-489奧沙利鉑(xaliplatin,L-HP)是第3代鉑類化合物,其化學(xué)名為左旋反式二氨環(huán)己烷草酸鉑。因?yàn)榕c順鉑作用機(jī)制有重要區(qū)別1,對各種順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞株無穿插耐藥,而且該藥無明顯腎毒性,耳毒性極微,血液學(xué)毒性較輕,神經(jīng)系統(tǒng)毒性主要為劑量依賴性的自限性外周神經(jīng)病變2,3，故近年來不但用于對順鉑耐藥的多種人類癌癥的二線治療4,5，而且臨床上已經(jīng)有代替順鉑作為一線治療的使用

6、6,7。體內(nèi)外試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)已證實(shí)了奧沙利鉑對晚期大腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等有較好療效8，但有關(guān)奧沙利鉑對人宮頸癌的作用及其機(jī)制的研究,國內(nèi)外報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過研究奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的生長抑制作用及對aspase-3活性的影響，旨在為其在宮頸癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料和方法1.1材料奧沙利鉑由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份消費(fèi)(N:06967),用前以無血清培養(yǎng)液配制。HeLa細(xì)胞株由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。TT為Siga公司產(chǎn)品,用PBS配成5g/L。RPI-1640培養(yǎng)液為GIB產(chǎn)品。胎牛血清:杭州四季青生物制品廠產(chǎn)品。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)試劑

7、盒(武漢博士德公司),EPISXL型流式細(xì)胞儀(Bekanulter公司)，aspase-3試劑盒購自凱基生物工程公司。aspase-3阻斷劑A-DEVD-H購自Pharingen公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng)將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含100L/L胎牛血清的RPI-1640培養(yǎng)基中內(nèi)含谷氨酰胺及100萬U/L青霉素和鏈霉素，置37、體積分?jǐn)?shù)5%2飽和濕度下培養(yǎng),每23d傳代1次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.3TT實(shí)驗(yàn)采用TT比色法,取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞5105/L，24h待大部分帖壁后分別參加不同濃度的奧沙利鉑2l/L、4l/L、8l/L、16l/L、32l/L、64l/L、128l/L、256l/L

8、,繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72,細(xì)胞對照組每孔參加20L培養(yǎng)液;空白對照組在鋪孔時(shí)不加細(xì)胞懸液,只加200L培養(yǎng)液。每個(gè)濃度各設(shè)3個(gè)平行孔,置37、5%2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)后,參加5g/LTT20L,繼續(xù)溫育4h后吸棄上清,參加二甲基亞砜(DS)150L,振蕩10in后,用自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀在波長490n處測定各孔A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按以下公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率:腫瘤細(xì)胞增殖抑制率=對照組吸光度A均值-實(shí)驗(yàn)組吸光度A均值/對照組吸光度A均值100%。1.4電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞分別參加2個(gè)100L培養(yǎng)瓶中,使每瓶細(xì)胞數(shù)為1106個(gè)。1瓶為陰

9、性對照,另1瓶參加奧沙利鉑后最終濃度32l/L,于37、體積分?jǐn)?shù)5%2條件下培養(yǎng)48h,調(diào)整經(jīng)胰蛋白酶消化后的細(xì)胞濃度至106/L，參加20g/L戊二醛固定后，由電鏡室按常規(guī)制備標(biāo)本，在透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并攝片。1.5原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡分組：對照組,草酸鉑作用組(8l/L、16l/L、32l/L、64l/L),每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔。把1106/L的HeLa細(xì)胞分別接種于24孔板中，同時(shí)在每個(gè)孔中放置載玻片后，于37、52下培養(yǎng)，爬片24h，按分組加藥，加藥完畢后在48h撈片。自然枯燥后用40g/L多聚甲醛固定，進(jìn)展TUNEL染色。TUNEL染色步驟按TUNEL原位凋亡檢測

10、試劑盒說明書進(jìn)展。光鏡下觀察凋亡細(xì)胞呈棕黃色，陰性細(xì)胞呈藍(lán)色。光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)(apptsisindes,AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100%。1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡將1106個(gè)HeLa細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,24h待大部分貼壁后，分別參加2種不同濃度的奧沙利鉑,使其終濃度分別為8l/L、32l/L,同時(shí)設(shè)對照組,各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后獲取細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,參加70%冷乙醇固定后重新搜集細(xì)胞,PBS洗去固定液,參加RNA酶反響過夜,與碘化丙啶(PI)染液混勻后,上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。1.7比色法檢測aspase-3活性取對數(shù)生長期的細(xì)胞(2105/L)

11、,試驗(yàn)組參加不同濃度的奧沙利鉑,對照組不加藥,培養(yǎng)24h、48h、72h后搜集細(xì)胞,PBS洗滌,冷的lysisbuffer懸浮細(xì)胞,置冰上20in,4,11000g離心3in,測定上清液蛋白濃度,汲取50L含50200g蛋白的細(xì)胞裂解液上清,參加50Lreatinbuffer,再參加5Laspase-3Substrate,并于37避光孵育4h,用酶標(biāo)儀(405n)測定吸光度,與對照組進(jìn)展比擬觀察aspase-3活化程度。1.8aspase-3抑制試驗(yàn)HeLa細(xì)胞濃度調(diào)整為2105/L,先參加抑制劑A-DEVD-H40L(0.1g/L),在37、5%2孵箱中孵育2h后,參加奧沙利鉑(終濃度16l

12、/L),再孵育72h后,分別檢測細(xì)胞凋亡率及aspase-3活性。測定結(jié)果與未加抑制劑的相應(yīng)結(jié)果進(jìn)展比擬。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS10.0軟件包。統(tǒng)計(jì)學(xué)采用單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、SPEARAN秩相關(guān)檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著性程度以P0.05判斷。2結(jié)果2.1奧沙利鉑對HeLa細(xì)胞生長的抑制作用4l/L以下的奧沙利鉑對HeLa細(xì)胞無生長抑制作用，各時(shí)間點(diǎn)在濃度加大到64l/L后處于平臺(tái)期，464l/L隨著奧沙利鉑劑量的增加和作用時(shí)間的延長,其對HeLa細(xì)胞的抑制率也明顯增加圖1。2.2顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)電鏡下見未處理組HeLa細(xì)胞外表有較多微絨毛

13、,細(xì)胞核大而圓,染色質(zhì)分散,核仁明顯。32l/L藥物處理48h后,較多HeLa細(xì)胞皺縮,體積變小，胞質(zhì)電子密度增高,有較多大小不等的空泡形成;染色質(zhì)聚集于核膜周圍,核固縮,有的碎裂成多塊圖2。2.3TUNEL染色檢測HeLa細(xì)胞凋亡結(jié)果不同濃度的奧沙利鉑作用48后,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞核染為棕黃色者為凋亡陽性細(xì)胞,細(xì)胞核染為藍(lán)色者為陰性細(xì)胞，奧沙利鉑組較陰性對照組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，且隨著濃度的增加，陽性細(xì)胞數(shù)也隨之增加。0、8、16、32、64?滋l/L組的細(xì)胞凋率%分別為1.11.2、7.41.1、14.22.4、22.52.1、25.46.3，與0?滋l/L組相比，4組濃度差異均有顯著意義

14、(P均=0.000，圖3)。2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果HeLa細(xì)胞經(jīng)奧沙利鉑(8l/L、32l/L)作用24后,G1期前出現(xiàn)亞二倍體峰即凋亡峰,明顯高于對照組。細(xì)胞凋亡率對照組為1.2%0.1%,8l/L奧沙利鉑組為6.30%2.61%,32l/L奧沙利鉑組為19.2%3.1%,兩用藥組與對照組凋亡率比擬，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t值分別為22.43,45.21P0.05，圖4。2.5奧沙利鉑對HeLa細(xì)胞aspase-3活性的影響不同濃度的奧沙利鉑(8l/L、16l/L、32l/L、64l/L)作用HeLa細(xì)胞株24h、48h和72h后,隨著奧沙利鉑濃度的增加和作用時(shí)間的延長,aspase

15、-3活性逐漸增強(qiáng)(表2)。在作用時(shí)間為24h時(shí)，采用SPEARAN秩相關(guān)檢驗(yàn)，奧沙利鉑濃度與aspase-3活性相關(guān)系數(shù)r=0.691、P=0.003；在濃度為16l/L時(shí)，作用時(shí)間與aspase-3活性相關(guān)系數(shù)r=0.824、P=0.000。說明奧沙利鉑對HeLa細(xì)胞的aspase-3活性的影響可能具時(shí)間和濃度依賴性。2.6aspase-3抑制試驗(yàn)結(jié)果16l/L奧沙利鉑參加抑制劑A-DEVD-H組aspase-3活性及細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為0.1360.024和13.21.4,而未加抑制劑組分別為0.2480.016和21.62.3,兩組aspase-3活性相比擬t值為2.539，P0.05；兩

16、組細(xì)胞凋亡指數(shù)相比擬t值為26.900，P0.01，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3討論宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤,是引起婦女癌癥相關(guān)死亡的重要原因，且發(fā)病率近年呈逐年上升趨勢和年輕化。過去認(rèn)為宮頸癌屬于化療藥物不敏感腫瘤,僅在晚期及復(fù)發(fā)的患者中將化療作為綜合治療的一部分。大量臨床理論已經(jīng)證明,部分治療手段不能控制腫瘤周圍肉眼看不見的微小轉(zhuǎn)移灶以及可能存在的全身亞臨床轉(zhuǎn)移。因此，近年來國內(nèi)外對化療在宮頸癌中的應(yīng)用進(jìn)展了根底及臨床方面的研究,獲得了滿意效果,進(jìn)步了患者5年生存率,從而確定了化療在宮頸癌治療中的地位,意識到化療在延長患者的生命和改善生活質(zhì)量方面起著重要的作用并提出了新輔助化療的概念,且術(shù)前輔助

17、化療越來越受到重視9。鉑類藥物是目前宮頸癌新輔助化療的主要用藥，傳統(tǒng)的金屬鉑類化合物抗腫瘤藥,如順鉑進(jìn)入人體后多積聚于肝、腎、膀胱,造成明顯腎損害,血液非蛋白氮升高及胃腸道反響等毒性,從而限制了臨床使用劑量的進(jìn)步。奧沙利鉑為順鉑類衍生物,可克制順鉑的缺乏之處,對各種順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞株無穿插耐藥,而且該藥無明顯腎毒性,耳毒性極微,血液學(xué)毒性較輕,神經(jīng)系統(tǒng)毒性主要為劑量依賴性的自限性外周神經(jīng)病變，與順鉑相比,奧沙利鉑能更有效抑制DNA合成,具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用,可以誘發(fā)DNA一級和次級損傷,引起人類腫瘤細(xì)胞凋亡1。因此,奧沙利鉑的問世,擴(kuò)大了鉑類化合物抗腫瘤藥的應(yīng)用范圍,單一或結(jié)合治療多種類型腫

18、瘤已顯示出良好的應(yīng)用前景,臨床上已經(jīng)有代替順鉑作為一線治療的使用。大量體外研究已證明,許多抗癌藥物的抗腫瘤作用不是殺傷腫瘤細(xì)胞而是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或兩種形式并存。由于藥物殺傷腫瘤細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞壞死,產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反響,因此,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也成為了現(xiàn)代抗腫瘤藥物治療的新策略。對宮頸癌放療前的輔助化療，尤其需要尋找誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，因?yàn)樗幬餁[瘤細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞壞死、缺氧，而缺氧可以降低腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。對于奧沙利鉑是否能誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡,國內(nèi)外報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)說明,464l/L的奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長有明顯的抑制作用,并且呈時(shí)間和劑量依賴性;原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNE

19、L)檢測顯示奧沙利鉑在一定濃度可誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡且呈劑量依賴性，流式細(xì)胞儀可檢測到細(xì)胞凋亡峰,電鏡下部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡特征,證明了一定濃度的奧沙利鉑可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。aspases活性的變化是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,目前認(rèn)為aspases是一切凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路,正常情況下,aspases在細(xì)胞內(nèi)以無活性的酶原形式存在,當(dāng)?shù)蛲鲞^程被啟動(dòng)后凋亡信號可傳導(dǎo)至aspases酶原,使其部分肽鏈發(fā)生水解,形成具有活性的aspases,然后各種aspases如同凝血過程一樣產(chǎn)生“瀑布式層層激活,最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡,目前已發(fā)如今人體內(nèi)的aspases共有14種,其中起核心作用的是a

20、spase-310-12。監(jiān)測aspase-3是否被激活可以幫助判斷奧沙利鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡是否與aspase-3活化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證明,奧沙利鉑在一定濃度可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡,aspase-3活性測定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡過程中確有aspase-3的激活,其活性強(qiáng)度亦呈劑量時(shí)間依賴性增高。抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)aspase-3活性與凋亡細(xì)胞百分率均下降,證明aspase-3參與了奧沙利鉑作用HeLa細(xì)胞的凋亡過程。另外還發(fā)現(xiàn)抑制試驗(yàn)對細(xì)胞凋亡僅是部分抑制,未加A-DEVD-H組細(xì)胞凋亡指數(shù)為21.62.3,參加抑制劑組細(xì)胞凋亡指數(shù)為13.21.4,是由于細(xì)胞凋亡受多基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié),還存在著不依賴于aspas

21、e-3激活的凋亡途徑,因此對奧沙利鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚需深化的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】RAYNDE,FAIVRES,HANEYS,etal.ellularandleularpharalgyfxaliplatinJ.lanerTher，2002,1(3):227-235.PASETTL,DANDRER,RSSIE,etal.xaliplatin-relatedneurtxiity:handhy?J.ritRevnlHeatl,2022,59(2):159-168.ASSIDYJ,ISSETJL.xaliplatin-relatedsideeffet:barateristisandanageentJ.Seinnl,2002,29(5Suppl5):11-20.王琳，秦叔逵，錢軍，等.奧沙利鉑結(jié)合氟尿嘧啶類藥物二線治療晚期胃癌的臨床研究J.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2022，133:361-362.KEAGEJ.Ne-generatinplatinudrugsinthetreatentfisplatin-res