冬凌草超臨界二氧化碳萃取物體外抑菌作用研究

1、冬凌草超臨界二氧化碳萃取物體外抑菌作用研究【摘要】目的考察冬凌草對(duì)細(xì)菌生長的抑制作用，并比擬超臨界提取產(chǎn)物與乙醇回流提取物的抑制效果。方法超臨界二氧化碳萃取冬凌草，管碟法證明萃取產(chǎn)物的抑菌才能，并用二倍稀釋法測(cè)定敏感菌的最小抑菌濃度(I)。結(jié)果冬凌草提取物在金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌生長平板上有很明顯的抑菌圈，超臨界提取物的最小抑菌濃度為g/l金黃色葡萄球菌0.03175，藤黃八疊球菌0.015875，枯草芽孢桿菌0.03175，大腸桿菌0.125，產(chǎn)氣桿菌0.125，綠膿桿菌0.0625，變形桿菌0.0625。結(jié)論冬凌草提取物對(duì)大多數(shù)的

2、細(xì)菌生長有抑制作用，而且超臨界提取物抑制效果明顯優(yōu)于乙醇回流提取物?！娟P(guān)鍵詞】冬凌草；超臨界二氧化碳萃?。灰志饔?；管碟法；二倍稀釋法；最小抑菌濃度AntiirbialTestfExtratsfrRabdsiarubesensAbstrat:bjetiveTevaluatethebateristasisfextratsfrRabdsiarubesens.ethdsTheylinder-plateethdasusedfriprvingthebateristasisfextratsfrRabdsiarubesens,hilethedublebrthdilutinethdasusedfrdeteri

3、ninginialinhibitrynentratinfsensitivebateria.ResultsTheextratsfRabdsiarubesenshadertaininhibitinznenediu.Theinialinhibitrynentratinfsuperritial2extratsas:Staphylusaureus,0.03175;Sarinalutea,0.015875;Baillussubtilis,0.03175;Esherihiali,0.125;Enterbateraergenes,0.125;Pseudnasaeruginsa,0.0625;Bailluspr

4、teus,0.0625g/l.nlusinTheextratsfrRabdsiarubesensareefetivenstbateria.Thesuperritialfluidextratsarebetterthanthealhlrefluxingextrats.Keyrds:Rabdsiarubesens;Superritial2Extratin;Bateristasis;ylinder-plateethd;Dublebrthdilutinethd;inialinhibitrynentrati冬凌草Rabdsiarubesens(Hesl.)Hara又名冰凌草，為唇形科香茶菜屬多年生草本植物

5、1。其中的冬凌草甲素是迄今為止研究最多，療效最為明確的貝殼杉烯二萜類化合物2。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明冬凌草甲素具有明顯的抗癌、降壓、抗菌、抗氧化等作用35。臨床主要應(yīng)用于治療急性咽炎，扁桃體炎6等。近年來，超臨界二氧化碳萃取技術(shù)由于其萃取才能強(qiáng)、萃取條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中藥的提取別離7。本實(shí)驗(yàn)中冬凌草提取物由超臨界二氧化碳提取法和傳統(tǒng)的乙醇回流法獲得。迄今為止，關(guān)于冬凌草的研究主要集中在抗癌、抗腫瘤藥理作用以及提取工藝等方面，對(duì)其抗菌作用的相關(guān)報(bào)道較少。因此本文對(duì)不同提取工藝冬凌草提取物的抗菌范圍進(jìn)展了考察，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)展比擬。1材料實(shí)驗(yàn)菌種(沈陽藥科大學(xué)微生物教研室提供：金黃色葡

6、萄球菌Staphylusaureus26001；枯草芽孢桿菌BaillussubtilisSYD63501；綠膿桿菌PseudnasaeruginsaSYD10104；藤黃八疊球菌SarinaluteaAT28001；大腸桿菌EsherihialiAT25923；產(chǎn)氣桿菌Enterbateraergenes；變形桿菌Baillusprteus；克氏桿菌Bailluskerleri。2方法2.1不同提取工藝將河南省濟(jì)源市藥材供給站提供的冬凌草全草，葉和莖大致分開，取葉多莖少的局部粉碎，枯燥至恒重，作為原料備用。2.1.1乙醇提取工藝取枯燥至恒重的冬凌草粗粉100g,加400l95%乙醇回流提取2

7、次，2h/次,先減壓過濾濾去殘?jiān)?，再常壓過濾濾去絮狀物，減壓蒸餾回收溶劑后，真空枯燥產(chǎn)物至恒重。經(jīng)分析，所得浸膏中甲素含量為4.13%。2.1.2超臨界流體萃取工藝取枯燥至恒重的冬凌草粗粉100g，以萃取壓力30Pa，萃取溫度50，夾帶劑為95%乙醇，夾帶劑量為150l，2流量4L/h，提取時(shí)間3h為超臨界萃取條件，獲得提取液。將提取液減壓蒸餾揮干溶劑，真空枯燥產(chǎn)物至恒重。經(jīng)分析，所得浸膏中甲素含量為10.12%。將乙醇回流提取獲得浸膏，作為供試品1號(hào)。將超臨界萃取獲得浸膏，作為供試品2號(hào)。以分析純甲醇為供試品3號(hào)。取1號(hào)樣品0.1g溶于甲醇中，過濾，定容于100l容量瓶中，配成1g/l的溶液

8、，制得供試品4號(hào)。取2號(hào)樣品，同方法制得供試品5號(hào)。取質(zhì)量濃度為1g/l的復(fù)方大青葉注射液山東某制藥，做為對(duì)照品6號(hào)。其中，1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)供試藥品，目的為確定冬凌草本身對(duì)細(xì)菌生長的抑制作用，消除溶劑干擾。2.2菌懸液的制備從活化斜面上取各種試驗(yàn)菌分別接種于5l無菌液體肉湯培養(yǎng)基中，置37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。2.3管碟法ylinder-plateethd抑菌實(shí)驗(yàn)分別取試驗(yàn)菌懸液0.5l加到90培養(yǎng)皿中，將融化態(tài)固體肉湯培養(yǎng)基20l傾倒至培養(yǎng)皿內(nèi)，搖勻，制成混菌平板。每種菌各制備三皿，做好標(biāo)記。待培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子取小鋼杯在培養(yǎng)基外表。每皿放置3個(gè)小鋼杯將3，4，5號(hào)供試藥品各取0.2

9、5l分別滴入小鋼杯中，取1、2號(hào)供試藥品放在平板上。將培養(yǎng)皿蓋換成陶土蓋。37恒溫培養(yǎng)24h。2.4最小抑菌濃度inialinhibitrynentratin,I的測(cè)定用二倍稀釋法(dublebrthdilutinethd)分別將4，5，6號(hào)供試藥品配制成質(zhì)量濃度為0.5,0.25,0.125,0.06251,0.03175,0.015875g/l，并另取一支不加藥品的空白液體培養(yǎng)基作為對(duì)照樣品。取1100試驗(yàn)菌液0.1l參加各試管中，搖勻，37培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。對(duì)照管長菌已混濁，這時(shí)能完全抑制試驗(yàn)菌生長的最高稀釋倍數(shù)管即為最小抑菌濃度。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果與討論3.1管碟法實(shí)驗(yàn)結(jié)

10、果數(shù)據(jù)見表1。表1管碟法實(shí)驗(yàn)結(jié)果略“+表示有菌生長，即實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)菌體無抑制效果；“-表示無菌生長，即實(shí)驗(yàn)品對(duì)菌體生長有抑制效果由表1可見，冬凌草對(duì)除克氏桿菌外的革蘭氏陽性陰性菌，均有明顯的生長抑制作用。3.2二倍稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見表2。表2二倍稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果略“+表示有菌生長，即實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)菌體無抑制效果；“-表示無菌生長，即實(shí)驗(yàn)品對(duì)菌體生長有抑制效果I數(shù)據(jù)見表3。表3I實(shí)驗(yàn)結(jié)果略由表3中的I可見，冬凌草提取物對(duì)藤黃八疊球菌生長抑制效果最好，對(duì)其它敏感菌的抑制作用要優(yōu)于復(fù)方大青葉注射液。并且超臨界萃取提取物比乙醇回流提取物的抑菌活性更好。3.3討論實(shí)驗(yàn)首先通過分析乙醇回流提取的冬凌草浸膏1號(hào)供

11、試藥品和超臨界二氧化碳提取的冬凌草浸膏2號(hào)供試藥品，確定了冬凌草提取物對(duì)除克氏桿菌外的敏感菌生長有抑制作用。甲醇3號(hào)供試藥品在混菌平板上無抑菌圈，說明溶劑對(duì)菌體生長沒有影響。乙醇回流提取物的飽和甲醇溶液4號(hào)供試品和超臨界二氧化碳提取物的飽和甲醇溶液5號(hào)供試品的結(jié)果與1號(hào)，2號(hào)供試藥品一致，說明甲醇與藥品混合后對(duì)藥品的抑菌作用無影響，所以選用甲醇作為溶劑方法可行，結(jié)果可靠。管碟法實(shí)驗(yàn)證明了冬凌草對(duì)除克氏桿菌外，金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌這些革蘭氏陽性菌及大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌這些革蘭氏陰性菌的生長均有抑制才能。敏感菌的I結(jié)果顯示，冬凌草的抑菌效果好于復(fù)方大青葉注射

12、液。由于超臨界提取物中甲素含量遠(yuǎn)高于乙醇回流提取物，冬凌草甲素為冬凌草主要抗菌成分，所以超臨界萃取產(chǎn)物的抑菌效果優(yōu)于乙醇回流提取物。4結(jié)論超臨界二氧化碳萃取法與傳統(tǒng)的乙醇回流提取法相比，操作簡單，條件溫和，無溶劑殘留，甲素含量高，抑菌作用更為明顯。與復(fù)方大青葉注射液相比，冬凌草對(duì)典型的臨床致病菌的生長抑制作用更好,可以考慮臨床應(yīng)用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1王紹豐,盧啟立.冬凌草的現(xiàn)代研究概況J.廣州醫(yī)藥,2022,39(1):46.2李欽,馮衛(wèi)生.冬凌草化學(xué)成分藥理作用及開發(fā)研究進(jìn)展J.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2022,18(6):31.3左海軍,李丹，吳斌，等.冬凌草的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性J.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2022,22(4):258.4冉倩,徐靜宜，吳曉明，等.冬凌草甲素的研究進(jìn)展J.藥學(xué)與臨床研究