生物化學A（上）7-蛋白質化學5-結構與功能及研究方法

1、蛋白質的結構與功能為什么研究蛋白質的結構與功能對蛋白質結構和作用機理的深層次理解對蛋白質結構進行改造的基礎對蛋白質功能的控制“隨心所欲”創(chuàng)造具有新功能的蛋白質蛋白質的一級結構與其構象及功能的關系蛋白質一級結構是空間結構的基礎，特定的空間構象主要是由蛋白質分子中肽鏈和側鏈R基團形成的次級鍵來維持，可根據(jù)一級結構的特點自然折疊和盤曲，形成一定的空間構象。 蛋白質的一級結構中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構象關鍵部位的殘基，即使在整個分子中發(fā)生一個殘基的異常，那么該蛋白質的功能也會受到明顯的影響。被稱之為“分子病”的鐮刀狀紅細胞性貧血僅僅是574個氨基酸殘基中，一個氨基酸殘基(亞基N端的第6號G

2、lu殘基)發(fā)生了變異所造成的，這種變異來源于基因上遺傳信息的突變。蛋白質的一級結構與功能的關系由較短肽鏈組成的蛋白質一級結構，其結構不同，生物功能也不同.由較長肽鏈組成的蛋白質一級結構中，其中“關鍵”部分結構相同，其功能也相同；“關鍵”部分改變，其功能也隨之改變。一級結構是空間構象的基礎 蛋白質一級結構決定空間構象，即一級結構是高級結構形成的基礎。只有具有高級結構的蛋白質才能表現(xiàn)生物學功能。實際上很多蛋白質的一級結構并不是決定蛋白質空間構象的惟一因素。除一級結構、溶液環(huán)境外，大多數(shù)蛋白質的正確折疊還需要其他分子的幫助。這些參與新生肽折疊的分子，一類是分子伴侶，另一類是折疊酶。一級結構是功能的基

3、礎 一級結構相似的多肽或蛋白質，其空間構象和功能也相似。相似的一級結構具有相似的功能，不同的結構具有不同的功能，即一級結構決定生物學功能。蛋白質一級結構的種屬差異與分子進化 從蛋白質氨基酸的序列可以了解到重要的生物進化信息。對于不同種屬來源的同種蛋白質進行一級結構測定和比較，發(fā)現(xiàn)存在種屬差異。蛋白質一定的結構執(zhí)行一定的功能，功能不同的蛋白質總是有不同的序列。若一級結構變化，蛋白質的功能可能發(fā)生變化。蛋白質的一級結構與分子病 蛋白質的氨基酸序列改變可以引起疾病，人類有很多種分子病已被查明是某種蛋白質缺乏或異常。這些缺損的蛋白質可能僅僅有一個氨基酸異常-分子病。同源蛋白質(不同生物中行使相同或相似

4、功能的蛋白質）一級結構的種屬差異性 細胞色素C是真核細胞線粒體內膜上一種含F(xiàn)e的蛋白質，在生物氧化中起傳遞電子的作用。通過數(shù)百種生物的細胞色素C一級結構的研究表明： （1）親緣關系越近，AA順序的同源性（相似性）越大。 不同生物與人的細胞色素C相比較，AA差異數(shù)目 黑猩猩 0 雞、火雞 13 牛豬羊 10 海龜 15 狗驢 11 小麥 35 粗糙鏈孢霉43 酵母菌 44 （2）盡管不同生物間親緣關系差別很大，但與細胞色素C功能密切相關的AA順序卻有共同之處，即保守順序不變。肌紅蛋白的結構與功能（1）肌紅蛋白的功能：哺乳動物肌肉中儲存氧并運輸氧的蛋白。（2）肌紅蛋白的結構特點（1963年，Ken

5、drew）： a .一條多肽鏈，153個氨基酸殘基，一個血紅素輔基，分子量17600。 b.肌紅蛋白的整個分子具有外圓中空的不對稱結構，肽鏈共折疊成8段-螺旋體（A-H），最長的有23個氨基酸殘基，最短的有7個氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。 c.具有極性側鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側鏈的氨基酸殘基多分布于分子內部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。肌紅蛋白的結構血紅素（鐵卟啉 ）輔基的結構及其氧合部位肌紅蛋白的氧合曲線 Y=Mbo2Mbo2+Mb(Y代表在給定的氧壓下肌紅蛋白的氧飽和度) Y=PO2K+PO2（1）（2）由（1）可見：Y=1時，表明所有肌紅蛋

6、白的氧合位置均被占據(jù)，即肌紅蛋白為氧飽和。由（2）可見： Y=0.5時，肌紅蛋白的一半被飽和，PO2=K 解離常數(shù)為肌紅蛋白一半被飽和時的氧壓。Po2Y1.00.510 20 30 40 50血紅蛋白的結構、功能及鐮刀形貧血?。?）血紅蛋白的功能：存在動物血液的紅細胞中，具有運輸O2和CO2的功能；血紅蛋白還能和H+結合，從而可以維持體內pH。（2）血紅蛋白的結構特點：a. 四個亞基的寡聚蛋白，574個AA殘基，分子量65000；b. 成人的血紅蛋白為22；c. 鏈由141 AA殘基組成， 鏈由146 AA殘基組成。 四個肽鏈的三級結構與肌紅蛋白相似，各自內部有一個血紅素輔基。血紅蛋白含有四條

7、肽鏈，每一條肽鏈各與一個血紅素相連接。血紅素同肽鏈的連接是血紅素的Fe原子以配價鍵與肽鏈分子中的組氨酸咪唑基的氮原子相連。血紅蛋白（Hemoglobin, Hb) Hb (Mr 64500)幾乎呈球形(d=5.5 nm)，四聚體，血紅蛋白的四級結構顯示了不同亞基間強的相互作用。11界面 (22) 間存在強相互作用，即使用尿素處理，得到的是完整的二聚體，界面間是明顯的疏水作用，但也存在許多氫鍵和一些離子對作用。結合氧后引起結構改變 血紅蛋白有兩個主要的構象：R態(tài)(relaxed)和T態(tài)(tense)，氧可以與兩種狀態(tài)結合，但對R態(tài)的親和力更大。無氧結合時，T態(tài)更穩(wěn)定，表現(xiàn)出去氧血紅蛋白的主要的構

8、象。T態(tài)因更多的離子對作用更為穩(wěn)定，其中的多數(shù)存在于12（及 21)界面間。氧與Hb一個亞基的T態(tài)結合，引起構象改變?yōu)镽態(tài)，當整個蛋白質發(fā)生這樣的構象改變，單個亞基的結構幾乎沒有改變。但亞基對相互滑動和旋轉，使得亞基間的口袋變窄。這一過程中，穩(wěn)定T構象的一些離子對被打破，同時產(chǎn)生一些新的離子對。去氧血紅蛋白的T狀態(tài)TR轉變。帶正電荷的側鏈（藍色）和帶負電荷的側鏈（粉紅色）形成離子對。每個亞基的Lys C5和每個亞基的Asp FG1能夠看到，未作標記。與氧結合時血紅蛋白的變構過程1.血紅素中鐵原子的變化 高自旋狀態(tài) 低自旋（非氧合，原子半徑較大） （氧合，原子半徑較?。┙Y合氧的血紅素附近的構象變

9、化。Max Perutz假定TR的轉變是由于血紅素周圍幾個關鍵氨基酸側鏈位置的改變所引起的。T態(tài)的血紅素輕微皺褶，引起血紅素鐵突出His的側鏈。氧的結合引起血紅素呈現(xiàn)更平坦的構象，將His側鏈改變而接觸F螺旋。2.亞基三級結構及整個蛋白四級結構的變化鐵原子的位移 F8His的位移 使F螺旋、EF拐角及FG拐角發(fā)生位移 F 螺旋向H螺旋移動 氫鍵斷裂 導致四級結構的鹽橋破壞 擠出BPG分子。脫氧血紅蛋白與氧合血紅蛋白構象的轉變 T R緊張態(tài) 松弛態(tài)構象緊密 構象松弛氧親和力低 氧親和力高血紅蛋白的變構別構蛋白：蛋白質分子中不止有一個配基的結合部位（活性部位），還有別的配基的結合部位（別構部位）。

10、別構蛋白都有別構效應。別構效應：蛋白質與配基結合后改變蛋白質的構象，進而改變蛋白質的生物活性的現(xiàn)象。別構蛋白一般都是寡聚蛋白質。O2HbHb- O2O2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線活動肌肉毛細血管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin血紅蛋白輸氧功能和構象變化S形（協(xié)同）結合曲線。可以看成反映低親和與高親和狀態(tài)轉變的雜合曲線。表明血紅蛋白在組織和肺之間對氧濃度微小差異更為敏感，使得血紅蛋白在高氧分壓的肺中能夠結合氧，在低分壓的組織釋放出氧。pH對氧與血紅蛋白結合的影響。肺中血液的pH為7.6，組織的血液pH為7.2，實驗測定血紅蛋白與氧

11、的結合在pH7.4。H+、CO2和BPG 對血紅蛋白結合氧的影響氧親和力：指血紅蛋白對于氧的結合牢固程度。（在一定氧分壓下，氧親和力越高，即氧結合越牢固。相反，氧親和力越低，組織就能得到更多的氧供應）H+、CO2的影響：1914年，C. Bohr發(fā)現(xiàn)，高濃度的H+和CO2促使氧合血紅蛋白分子釋放O2，而高濃度的O2促使脫氧血紅蛋白分子釋放H+和CO2血紅蛋白對O2、 H+和CO2結合的這種相互關系叫波耳效應。HbO2 +H+ +CO2HbH+CO2+ O2肌肉pH7.2肺泡pH7.6波耳效應的生理意義BPG的影響：BPG和O2對血紅蛋白的結合是排斥的BPG降低血紅蛋白親氧能力的重要生理意義：

12、BPG是紅細胞中存在的糖代謝中間產(chǎn)物。當血液流經(jīng)O2分壓較低的組織時，紅細胞中的BPG可促進氧合血紅蛋白釋放氧，以滿足組織對O2需要。 BPG濃度越大， O2的釋放量越多。紅細胞中BPG濃度的變化是調節(jié)血紅蛋白對氧親和力的重要因素。實例：在高山上；肺氣腫病人；儲藏血液。Po2Y1.0 0.5有BPG氧與血紅蛋白的結合受2,3-二磷酸甘油酸（BPG）的調控 2,3-二磷酸甘油酸(BPG)與Hb的作用表現(xiàn)為一種向異性的變構調控行為。紅細胞中BPG的濃度相對較高。BPG能大大降低Hb對氧的親和力。 HbBPG + O2 HbO2 + BPG BPG結合Hb的位點與氧的不同，可以調控肺中與氧分壓相關的

13、氧與Hb的親和力。高緯度時，BPG對于較低氧分壓的生理適應起著重要作用。健康人體在海面上能釋放40%的氧進入組織，如果被迅速轉移到4500米的山上(pO2低)，其向組織釋放氧的能力降低。幾個小時后血液BPG的濃度上升，降低Hb與氧的親和力，這種調節(jié)對于肺中氧的結合影響不大，但對組織中氧的釋放影響很大，可以恢復釋放血液攜帶氧的40%進入組織。正常人位于海平面時血液中的BPG約為5 mM，高緯度時約為8 mM。BPG與去氧血紅蛋白的結合。BPG的結合穩(wěn)定去氧Hb的T態(tài)(a)，BPG所帶負電荷與T態(tài)亞基口袋周圍的正電荷側鏈作用(b)，由于氧的結合，T態(tài)轉變?yōu)镽態(tài)，BPG結合的口袋消失(c)。煤氣中毒

14、的機制一氧化碳（CO）也能與血紅素Fe原子結合。由于CO與血紅蛋白結合的能力是O2的200倍，因此，人體吸入少量的CO即可完全抑制血紅蛋白與O2的結合，從而造成缺氧死亡。急救方法是盡快將病人轉移到富含O2的環(huán)境中（如新鮮空氣、純氧氣或高壓氧氣），使與血紅素結合的CO被O2置換出來。血紅蛋白分子病Molecular Disease of Hemoglobin有時候蛋白質上的一個點突變會造成對蛋白質結構和功能的巨大影響鐮刀狀細胞貧血病（Sickle-Cell Anemia）基因變異直接影響蛋白質特性，表現(xiàn)出不同遺傳性狀。例如人的鐮形紅血球貧血癥。紅血球碟形 HbAHbS突變HbC 紅血球鐮刀形血紅

15、蛋白分子有四條多肽鏈： 兩條鏈(141個氨基酸/條)； 兩條鏈(146個氨基酸/條)。 HbA、Hbs 、Hbc氨基酸組成的差異在于鏈上第6位上氨基酸（亞基完全相同）：HbA第6位為谷氨酸（GAA、GAG)；HbS第6位為纈氨酸（GUA、GUG)；HbC 第6位為賴氨酸（AAA、AAG）由于鏈一個氨基酸的突變（6Glu6Val），去氧血紅蛋白S的表面換成了一個疏水側鏈，進一步引起分子發(fā)生線性締合，形成長鏈，多條長鏈進一步聚集成多股螺旋的不溶性纖維。HbS與HbA的四級結構差別不大，但在低氧（脫氧）時，HbS的溶解度急劇下降（為正常脫氧Hb的1/25）。產(chǎn)生貧血癥的原因：單個堿基的突變引起氨基酸

16、的改變導致蛋白質結構發(fā)生變化，直接產(chǎn)生性狀變化。正常碟形紅血球轉變?yōu)殓牭缎渭t血球缺氧時表現(xiàn)貧血癥。 HbAHbS HbC蛋白質結構與功能的關系及其研究方法1、研究方法2、免疫體系中分子間的識別機制3、DNA與蛋白質的相互作用4、蛋白水解酶與疾病5、膜蛋白、受體與信號轉導6、酶抑制劑與藥物開發(fā) 7、新技術與新方法 X-Ray衍射NMR (核磁共振)Molecular Modeling (Simulation)Mutation/Function (分子生物學)結晶困難分子量不能太大理論不太完善費時費力免疫體系分子的識別機制Helper T cell-免疫體系的關鍵細胞 輔助T細胞巨噬細胞：吞噬抗原

17、-加工抗原-遞呈給休止的輔助T細胞-輔助T細胞被活化-（1）激活免疫系統(tǒng)攻擊已識別的抗原；（2）增生B細胞；（3）增生殺傷T細胞MHC IIKiller T Cell-保衛(wèi)我們的主要戰(zhàn)士殺傷T細胞對抗入侵細胞的衛(wèi)士，但必須激活，首先要識別和結合特定的抗原片段-遞呈抗原-MHC I-激活的殺傷T細胞進攻帶有識別抗原的病毒并消滅之。MHC I兩種T細胞上的MHC分子是特異性識別的關鍵主要組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)早期從組織器官移植實驗中發(fā)現(xiàn)，也是當今免疫遺傳學的主要內容。已發(fā)現(xiàn)，在人群或同種動物不同個體間進行皮膚移植時出現(xiàn)的排斥反應

18、，具有記憶性、特異性和可轉移性等免疫反應的基本特征，故從廿世紀40年代起就確認移植排斥反應是一種典型的免疫現(xiàn)象。引起排斥反應的抗原稱移植抗原(transplantation antigen)或組織相容性抗原(histocompatibility antigen)。此等抗原存在于細胞表面，無器官特異性，不同個體間其抗原特異性互不相同，但同卵雙生及純系動物不同個體之間，其抗原特異性完全一致。 類分子構槽(A)和類分子構槽(B)示意圖 人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)。 HLA I類分子HLA II類分子MHC I類抗原分子頂部1和2區(qū)組成的抗原肽結合區(qū)呈溝槽

19、狀結構，1和2區(qū)各含4股片層和1個螺旋，呈對稱排列而連接成一個溝槽，片層組成槽底，其兩側由螺旋組成。溝槽大小為2.5 nm1.0 nm1.1 nm，可容納8-12個氨基酸殘基組成的短肽。溝槽內氨基酸變化大，是類抗原多態(tài)性的基礎。雖然抗原肽與類分子的結合有一定的選擇性，但并不像抗原與抗體那樣高度特異地結合，只要被結合的多肽有2-3個關鍵的氨基酸能恰當?shù)剡B接到溝槽內的多肽結合基序(binding motif)的相應位置上，多肽即可與之結合，并被運送到細胞表面遞呈給T細胞。所以每個類抗原分子能與一定廣度的多肽譜結合。鏈由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)組成。胞外區(qū)可進一步分為1、2和3 三個功能區(qū)?？缒^(qū)含疏

20、水性氨基酸，排列成螺旋跨越脂質雙分子層。胞內的氨基酸被磷?；笥欣诩毎庑畔⑾虬麅葌鬟f。2m無同種特異性，與3功能區(qū)連接，其功能為有助于類抗原的表達和穩(wěn)定性。MHC1分子的結構容納抗原的口袋MHC II，1和1區(qū)各自盤繞成一個螺旋和片層構成溝槽的一個側壁和半個底面。由于它的末端是開放的，故可容納較長的多肽(約12-20個氨基酸)。該溝槽與多肽結合的特點基本上與類抗原相似，但被結合的多肽一般來自外源性抗原經(jīng)加工處理降解的產(chǎn)物。 類抗原是由類基因編碼的鏈(34kD)和鏈(29kD)非共價連接的糖蛋白。鏈和鏈在內質網(wǎng)分別合成后，很快與第3條鏈鏈(或稱Ii鏈)結合成復合體，當復合體到達（內體/溶酶體

21、樣結構)，鏈解離、降解。鏈的存在，使、鏈不能與其他胞內蛋白結合，并協(xié)助復合體轉運到MHC，使之與抗原結合。鏈和鏈，均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)組成。胞外區(qū)各含兩個功能區(qū)1、2和、2 蛋白質與DNA的相互作用Helix-Turn-Helix (HTH)Helix-Loop-Helix (HLH)Zinc-fingerLeucine zipper非特異性:特異性:HistonesDNA-蛋白質相互作用的化學鍵1、氫鍵:具有識別功能蛋白質的螺旋結構常與DNA的大溝相互作用。2、疏水鍵：暴露于大溝側緣的T-CH3基團是疏水性的，可與疏水氨基酸殘基側鏈相互作用。3、離子鍵：蛋白質的帶電的氨基酸殘基的側鏈與

22、DNA分子上的帶電基團形成離子鍵。組蛋白(Histone) 組蛋白（與DNA非特異性結合） 組蛋白帶正電荷，含Arg、Lys，堿性蛋白，含量恒定，真核細胞中組蛋白共有5種，分為兩類：一類是高度保守的核心組蛋白（core histone）包括H2A、H2B、H3、H4四種；另一類是可變的連接組蛋白（linker histone）即H1。 核心組蛋白的結構非常保守，特別是H4，牛和豌豆H4的102個氨基酸中僅有2個不同。核心組蛋白高度保守的原因可能有兩個：其一是核心組蛋白中絕大多數(shù)氨基酸都與DNA或其它組蛋白相互作用，可置換而不引起致命變異的氨基酸殘基很少；其二是在所有的生物中與組蛋白相互作用的D

23、NA磷酸二酯骨架都是一樣的。四種核心組蛋白通過C端疏水的氨基酸相互結合，N端帶正電荷的氨基酸向外伸出，與DNA分子結合，使DNA分子纏繞在組蛋白核心周圍，形成核小體。尾部含有大量Lys和Arg殘基，為組蛋白翻譯后進行修飾的部位，如乙?；?、甲基化、磷酸化等。 H1不僅具有屬特異性，而且還有組織特異性，所以H1是多樣性的。核小體的結構要點 每個核小體單位包括約200 bp的DNA、一個組蛋白核心和一個H1。 由H2A、H2B、H3、H4各兩分子形成八聚體，構成盤狀核心顆粒； H3、H4形成4聚體，位于顆粒中央； H2A、H2B二聚體分別位于兩側。 DNA分子以左手螺旋纏繞在核心顆粒表面，每圈80

24、bp，共1.75圈，約146 bp，兩端被H1鎖合， H1 結合20bp DNA. 相鄰核心顆粒之間為一段60 bp的連接線DNA (linker DNA)，典型長度60 bp。 組蛋白與DNA是非特異性結合，核小體具有自組裝性質。非組蛋白 非組蛋白是染色體上與特異DNA序列結合的蛋白質，又稱序列特異性DNA結合蛋白（凝膠遲滯電泳實驗）。包括多種參與核酸代謝與修飾的酶類、核質蛋白、骨架蛋白、基因表達和染色體結構調節(jié)蛋白等。（1）非組蛋白的特性 含有較多的Asp和Glu，酸性蛋白質；整個細胞周期都進行合成，不象組蛋白只在S期合成，并與DNA復制同步進行；能識別特異的DNA序列，識別信息存在于DN

25、A本身，位點在大溝部分，識別與結合靠氫鍵和離子鍵；具有多樣性和異質性；具有多種功能，如幫助DNA分子折疊，以形成不同的結構域，從而有利于DNA的復制和基因的轉錄，協(xié)助啟動DNA復制，控制基因轉錄，調節(jié)基因表達。（2）序列特異性DNA結合蛋白的結構模式 螺旋-轉角- 螺旋模式（HTH) 蛋白質形成對稱的同型二聚體，每個單位由20個氨基酸的小肽組成，兩個螺旋相互連接成轉角。羧基端的螺旋負責識別DNA大溝的特異堿基信息，另一個螺旋與磷酸戊糖鏈骨架接觸。 鋅指模式 (Zinc Finger) 每個鋅指單位是一個DNA結合結構域，由30個左右氨基酸殘基組成，其中一對Cys和一對His與Zn2+形成配位鍵

26、，鋅指的C端形成 螺旋負責與DNA結合。亮氨酸拉鏈式模式 (Leucine Zipper) 蛋白質肽鏈的羧基端約35個氨基酸殘基有形成a螺旋的特點，每兩圈（7個氨基酸殘基）有一個Leu殘基。 螺旋一側的Leu排成一列，兩個螺旋間靠Leu間的疏水作用力形成一條拉鏈狀結構。HTH Motif最初發(fā)現(xiàn)于噬菌體的阻遏蛋白中，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在很多原核及真核DNA結合蛋白中存在。由兩個較短的螺旋與其間含Gly殘基的絞鏈組成。如大腸桿菌的CAP蛋白含一HTH結構域，HTH通過DNA雙螺旋大溝識別、結合反向重復序列TGTG/CACA。蛋白質與DNA的相互作用Helix-turn-helix，HTHHTH的分子識別機制

27、鋅指結構(Zinc Finger Structure) 鋅指結構：基因調控的轉錄因子存在于致癌基因、果蠅控制發(fā)育的基因、受生長因子和分化信號誘導合成的蛋白質序列中。 鋅指區(qū)域：由四個Cys或二個Cys及二個His組成；保守序列Cys-N2-4-Cys-N12-14-His-N3-His。 鋅指蛋白：213個手指，各由23氨基酸組成，并由78個氨基酸連接；與DNA大溝結合并環(huán)繞DNA分子，大溝與特異DNA堿基相互作用。Zinc-finger蛋白結構特征指狀結構約含23個氨基酸殘基，鋅以4個配價鍵與4個Cys或2個Cys和2個His相結合。整個蛋白質分子可有2-9個這樣的鋅指重復單位。每一個單位可

28、以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。如與GC框結合的轉錄因子SP1中就有連續(xù)的3個鋅指重復結構。Cys2/His2鋅指結構12 AAs堿性亮氨酸拉鏈 (bZIP)可形成蛋白質蛋白質二聚體的亮氨酸拉鏈 (leucine zipper，LP)；具有35個氨基酸殘基，其中有4個亮氨酸，每7個氨基酸出現(xiàn)一次，形成-螺旋時， 每兩圈伸出一個亮氨酸，由亮氨酸殘基間的疏水作用力形成一條拉鏈，產(chǎn)生蛋白質二聚體；堿性-螺旋與DNA磷酸殘基和堿基互作，二聚體剪刀結構。Leucine-zipper的結構特征蛋白質分子的肽鏈上每隔6個氨基酸就有1個亮氨酸殘基，結果就導致這些亮氨酸殘基都在螺旋的同一個方向出

29、現(xiàn)。兩個相同結構的兩排亮氨酸殘基就能以疏水鍵結合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負電荷的磷酸基團結合。若不形成二聚體則對DNA的親和結合力明顯降低。這類蛋白質能夠與CAAT框和病毒增強子結合。 Leucine Zipper蛋白的剪刀型結合模式足跡法研究DNA結合蛋白的結合位點DNA Foot Printing足跡法技術用于測定與特殊蛋白質結合在DNA上的結合位點和相應的核苷酸順序。如該技術提供了RNA聚合酶與啟動子之間相互作用的信息并確定了作用位點（啟動子）的核苷酸順序。研究蛋白質在DNA上的結合位點的Foot Printing由含70RNA多

30、聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動子蛋白水解酶與人類疾病Cardiovascular diseases 心血管疾病Hemophilia A/B 血友病Programmed cell death / appotosis 細胞凋亡Alzheimer disease 癡呆Cancer metastasis 癌細胞轉移Pulmonary emphysema/pancreatitis/arthritis 肺氣腫/胰腺炎/關節(jié)炎Parasite disease: malaria/T cruzain 瘧疾Influenza A & AIDS 甲型流感與愛滋病細胞內蛋白質有確定的壽命Proteosome是蛋白質降

31、解的專業(yè)機構蛋白質降解的泛素蛋白酶體途徑 泛素(ubiquitin，Ub)是76個氨基殘基組成的小分子多肽，可以以共價結合的方式與蛋白質的賴氨酸殘基相連。蛋白質一旦接有泛素，稱為發(fā)生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在ATP的參與下被三種酶依序催化，形成蛋白質與一條泛素聚合鏈相結合的復合結構，進入蛋白酶體，然后降解為肽段。此為生物大分子在胞質中降解的泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteosome pathway)。泛素化是一個具有普遍意義的免疫生物學現(xiàn)象。蛋白質降解的泛素蛋白酶體途徑 蛋白質泛素化系統(tǒng)由3個組分構成，一個稱為泛素激活酶E1，它可利用水解ATP釋放的能量以

32、其 Cys的巰基與泛素C端的Gly形成高能硫酯鍵。然后連接在其上的泛素被轉移到另一個泛素結合酶E2上，同時，被選中的靶蛋白與第三個組分即靶蛋白泛素連接酶E3結合。E2然后將與其連接的泛素轉移到靶蛋白上，并與靶蛋白 Lys -NH2基團形成異肽鍵(isopeptide bond)，E2被釋放。選擇什么樣的蛋白質進行泛素化主要取決于E2和E3。血栓形成（Thrombosis） 活體心臟、血管內血液的某些成分析出，凝集形成固體質塊的過程稱血栓形成，形成的固體質塊叫血栓。內膜損傷后血小板粘集，形成血小板小堆；以后內源性凝血系統(tǒng)、外源性凝血系統(tǒng)激活，形成纖維蛋白，血小板與纖維蛋白等形成血小板血栓，阻礙血

33、流，血流下游形成漩渦，形成新的血小板血栓，如此往復形成不規(guī)則梁索狀或珊瑚狀突起，稱為血小板小梁，在小梁間則由網(wǎng)有大量紅細胞的纖維蛋白網(wǎng)填充。后血栓逐漸增大，阻塞血管，血流停止，血液發(fā)生凝固，形成更大血栓。 血栓形成與消除1. 溶解吸收2. 機化再通3.軟化脫落栓子栓塞梗死 組織型纖溶酶原激活劑 纖溶酶原激活物抑制物 血纖維蛋白溶酶原 溶纖酶甲型流感病毒與艾滋病毒流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是引起流感的病原體。流感是一種上呼吸道急性傳染病，它傳染性強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高。已引起數(shù)次世界性大流行，僅19181919年的世界大流行，死亡人數(shù)就達2000萬，對人類的生命健康危害極大。Influ

34、enza Virus流感病毒（Influenza virus）屬正粘液病毒科，流感病毒屬，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原變異性最強，感染人類和其他動物，引起中、重度疾病，侵襲所有年齡組人群，常引起世界性大流行。乙型變異性較弱，僅感染人類，一般引起輕微的疾病，主要侵襲兒童，可引起局部爆發(fā)。丙型抗原性比較穩(wěn)定，僅引起嬰幼兒感染和成人散發(fā)病例。甲型流感病毒根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為15個亞型（H1H15），N有9個亞型（N1N9）。其中僅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人類，其它許多亞型的自然宿主是多種禽類和動物。其中對禽類危害最大的為H5、H7和H9亞型毒株。 Life Cyc

35、le of Influenza A virusA型流感病毒的H抗原蛋白的結構域受蛋白水解酶活化后才有感染細胞的能力艾滋?。ˋIDS)艾滋病的醫(yī)學全稱是“獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，縮寫AIDS ）”，其病原為“人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，縮寫HIV）”。HIV專門攻擊人體的T淋巴細胞，致使人體免疫功能缺陷，進而導致人體喪失了對各種病原體的抵抗能力而發(fā)生多種機會性感染、惡性腫瘤和多系統(tǒng)損害的綜合征，最終導致死亡。外界環(huán)境中的生存能力較弱，對物理因素和化學因素的抵抗能力較低。對熱很敏感，

36、56 處理 30min 可使其在體外對人的 T淋巴細胞失去感染性，但 不能完全滅活血清中的HIV，100處理20 min可將其完全滅活。除此之外，75%的酒精也可滅活，但紫外線不能滅活。變異強：艾滋病毒的變異性很強，給研制預防性疫苗和治療性藥物帶來了極大困難。易感性：人群普遍易感，無國界、無季節(jié)性。HIV感染與人類的行為密切相關，如：多性伴、吸毒等。env：囊膜蛋白（包膜蛋白） gag：核心蛋白Gag：gag基因產(chǎn)生55 kD的蛋白p55，p55由病毒編碼的一個蛋白酶切成四個小蛋白：MA（p17基質）、CA（p24衣殼）、NC（p9核衣殼）、及p6。 Pol：Gag-Pol融合蛋白由病毒編碼的

37、一個蛋白酶切為四個小蛋白：Pro（p10蛋白酶）、RT（p50逆轉錄酶）、RNase H（p15 RNA酶H）、及INT（p31整合酶）。Env：Env起先是160 kD的蛋白，在高爾基體中經(jīng)糖基化，在天冬酰胺上被加上25至30個復雜的N連糖鏈，成為gp160；這個糖基化過程對感染性是必要的，之后，宿主細胞的一個蛋白酶將gp160切為gp41與gp120。 AIDS病毒生活史有個必須的Protease癌細胞的轉移需要蛋白水解酶的幫助組織蛋白酶B可消化層粘連蛋白、纖粘連蛋白、膠原、蛋白聚糖及其他基底膜組分，因此有人推測該酶可能與癌細胞轉移有關。后來在人前列腺癌的侵襲細胞和毛細血管中證實了這一推測

38、。這種酶也許可以作為癌轉移的標志物，胃腸道癌癥病人的血清和尿液中酶的含量都高于健康人群。更重要的是肝、肺癌轉移的患者該酶的含量高于未轉移者。惡性腫瘤切除后可恢復至正常水平?；啄さ南饔檬鼓[瘤細胞得以進入結締組織，因此腫瘤細胞的攻擊性與蛋白水解酶水平呈正相關不足為奇。膜蛋白、受體與信號轉導白細胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6) 細胞來源: 主要由單核巨噬細胞、 Th2細胞、 血管內皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生。主要功能（1）刺激活化細胞增殖，分泌抗體； （2）刺激細胞增殖及CTL活化；（3）刺激肝細胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應；（4）促進血細胞發(fā)育。白介素-6(Interle

39、ukin-6)的信號轉導STAT:signal transducer and activatior of transcription(信號轉導子和轉錄激活子）JAK: janus kinase Acute-phase response factor成纖維細胞生長因子（FGFs） 主要來自牛腦和腦垂體的提取液，是大約150 個氨基酸結構的酸性或堿性成纖維細胞生長因子（FGF：FGF1或FGF：FGF2），氨基酸的同源性為20%50% 。其后分離的癌基因產(chǎn)物的細胞增殖因子與上述FGFs結構類似，也被分類在FGFs家族，并依次命名為FGF3 9。目前已發(fā)現(xiàn)23種 FGFs。 FGFs作為細胞間信號分

40、子在胚胎發(fā)生和分化過程中起重要作用。FGF的信號轉導幾條信號轉導途徑什么是生物芯片技術？以微點陣排列技術（Microarray Technology）將生物大分子固定到適當?shù)墓腆w載體上，方便各種生化和分子生物學的操作。蛋白質芯片技術（Protein Chips，Protein Array）基本原理：將高度密集排列的蛋白質分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析。依據(jù)的雜交反應原理:抗原-抗體反應配體-受體反應蛋白質-蛋白質相互作用蛋白質芯片的操作過程1.將抗原或抗體交聯(lián)（UV）或吸附在膜上；2. 抗體或抗抗體標記示

41、蹤；酶：HRPO、AP膠體金熒光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻膽蛋白等3.檢測標本中的抗體或抗原。點抗原測抗體點抗原測抗體點抗體測抗體-捕獲法點抗體測抗原蛋白質芯片篩選新藥的原理受體、酶的微點陣與中草藥抽提物反應后再與受熒光標記的配體或底物結合以激光進行檢測不出現(xiàn)熒光的點表明中草藥樣品中含有與這些點上的蛋白質相互作用的物質，因此是作用于這些位點的新藥候補。熒光基因芯片操作程序經(jīng)典的DNA芯片數(shù)據(jù)DNA芯片的操作過程利用半導體技術的DNA芯片酵母雙雜交(Yeast Two Hybrid) 技術蛋白質和蛋白質的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎。隨著分子生物學技術的發(fā)展，特別是人類基因組計

42、劃的完成，使人類對基因的結構和功能的認識不斷加深，但基因編碼的蛋白質的功能研究尚是一個難題。酵母雙雜交系統(tǒng)利用酵母遺傳學方法分析蛋白質之間的相互作用，該方法建立以來，經(jīng)過不斷的完善和發(fā)展，不但可以檢測已知蛋白質之間的相互作用，更重要的在于發(fā)現(xiàn)新的與已知蛋白相互作用的未知蛋白質。酵母雙雜交的原理利用酵母作為真核蛋白質相互作用的模型利用誘餌質粒篩選文庫或者單個已知蛋白通過報告基因的轉錄鑒定蛋白的相互作用使用不同的培養(yǎng)基篩選陽性克隆酵母雙雜交由Fields 等在1989 年提出，是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究。GAL4包括兩個彼此分離的但功能必需的結構域，位于N 端1-

43、174 位氨基酸殘基區(qū)段的DNA 結合域(DNA-BD)和位于C 端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉錄激活域(Activation domain，AD)。DNA-BD 能夠識別位于GAL4 效應基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence, UAS)，并與之結合。而AD 則是通過與轉錄機構(transcription machinery)中的其他成分之間的結合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉錄。DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現(xiàn)完整的GAL4轉錄因子活性并可激活U

44、AS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。酵母雙雜交體系UAS: Upstream activating sequence,酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白質蛋白質的相互作用。主要有二類載體: a. 含DNA -binding domain的載體; b. 含DNA-activating domain的載體。上述二類載體在構建融合基因時， 測試蛋白基因與結構域基因必須在閱讀框內融合。融合基因在報告株中表達，其表達產(chǎn)物只有定位于核內才能驅動報告基因的轉錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence, NLS)， 而GAL4-

45、ad沒有。因此在GAL4-ad氨基端或羧基端應克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。 另一個重要的元件是報道株，報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reporter gene)的重組質粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞， 酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點: 1 易于轉化、便于回收擴增質粒。2具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。3酵母的內源性蛋白不易與來源于哺乳動物的蛋白結合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉錄調控因子的DNA結合結構域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個基因融合到轉錄激活結構域(如GAL4-ad， VP16)。激活結構域融合基因轉

46、入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報道基因表達(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結合作用。 酵母雙雜交模型DNA-BindingDomain誘餌蛋白Bait Protein捕獲（獵物）蛋白Prey ProteinTranscriptionActivatingRegionReporter GeneDNA-Binding Site模 型文庫篩選的步驟將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結合域融合構建誘餌質粒。將誘餌質粒轉化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉化的酵母。再將文庫質粒轉化到酵母中。通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。轉基因動物Transgenic Animals什么是轉基因動物 將克隆的外源基因注射到一個受精卵的細胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長為后代，其中的部分后代其細胞中都攜帶有轉 入的外