蛋白質(zhì)定量比活性介紹km值測定

1、蛋白質(zhì)定量方法比活性介紹Km測定By 鄒宸 高漫辰鄒運劉偉凱氏定氮法原理：食品與硫酸和催化劑一同加熱 分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨 堿化蒸餾使氨游離 用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定反應(yīng)步驟：1、有機物中的胺根在強熱和CuSO4、濃H2SO4 作用下硝化生成（NH4）2SO42、與堿作用 蒸餾釋放出NH3 收集于H3BO3 溶液中3、用已知濃度的酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定注意事項：計算所得結(jié)果為樣品總氮量 如欲求得 樣品中蛋白含量 應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得非蛋白氮可用三氯乙酸沉淀分離凱氏定氮法缺點靈敏度低（適用于0.2 1.0mg氮）費時太長（810小時)易受非蛋白氮干擾雙縮脲法原理：雙縮脲反應(yīng)：雙

2、縮脲與CuSO4在強堿性溶液中形成紫色絡(luò)合物蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)于540nm處進(jìn)行比色測定 可得蛋白質(zhì)含量雙縮脲試劑： 1.50克硫酸銅+ 6.0克酒石酸鉀鈉+ 300毫升10% NaOH溶液，定容至1升雙縮脲法操作步驟取12支試管分兩組 分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用水補足到1毫升分別加入4毫升雙縮脲試劑第一支試管作空白組，于540nm處進(jìn)行比色測定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線雙縮脲法優(yōu)缺點優(yōu)點：較快速（2030分）、干擾物質(zhì)少缺點：靈敏度差（范圍為110m

3、g蛋白質(zhì)）雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定Folin酚試劑法原理：蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合 形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原 產(chǎn)生藍(lán)色化合物利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系 作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度主要試劑試劑甲：(1)4碳酸鈉(Na2CO3)溶液 (2)0.2N氫氧化鈉溶液 (3)1硫酸銅溶液(CuSO45H2O) (4)2酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀或鈉)試劑乙：磷鉬酸-磷鎢酸混合液實驗步驟試劑甲使蛋白質(zhì)發(fā)生烯醇化反應(yīng) 在堿性條件下形成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物試劑乙使鎢酸、鉬酸兩者同時失去氧原子 還原形成特殊的藍(lán)色于700nm處測定各管中

4、溶液的吸光度值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線注意事項Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深 因此各項操作必須精確控制時間顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化 因而此法通常適用于測定蛋白質(zhì)相對濃度優(yōu)缺點優(yōu)點：靈敏度高（5mg）缺點：易受干擾（硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、各種硫醇）、操作較嚴(yán)格紫外吸收法原理：蛋白質(zhì)中的共軛雙鍵對紫外光有吸收作用其最大值在280nm波長處蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其含量成正比 實驗步驟將已知不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在280nm處測定作標(biāo)準(zhǔn)曲線 即可求得未知溶液的蛋白質(zhì)濃度優(yōu)缺點優(yōu)點：簡便、靈敏、快速 不消耗樣品 測定後能回收使用缺點：易被核酸干擾考馬斯亮藍(lán)法（bradford法）原理：考

5、馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。 考馬斯亮藍(lán)法（bradford法）注意：該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。步驟：1Bradford濃染液的配制：2標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：3將待測樣本溶于緩沖溶液中；4用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液；5每個樣本與染料結(jié)合溶液，測定其吸光度。6根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣本的濃度。 考馬斯亮藍(lán)法（bradford法）優(yōu)點： 1、靈敏度高 2、快速簡便 3、干擾物質(zhì)少缺點： 1、用于不同蛋白測定有較大偏差

6、 2、仍有些物質(zhì)干擾 3、也有輕微的非線性二喹啉甲酸（BCA）法原理： 堿性溶液中，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，再與BCA生成藍(lán)紫色復(fù)合物，在波長562nm有最大吸收，強度正比于蛋白質(zhì)濃度。優(yōu)點： BCA檢測法提高了蛋白檢測靈敏度和特異性，消除了核酸的干擾，核酸干擾在對細(xì)胞裂解物或其他生物樣品進(jìn)行蛋白定量時總是一個難以避免的干擾。BCA（bicinchoninic acid ）法 這是近幾年興起的一種新的測定蛋白質(zhì)的方法，現(xiàn)已報道絡(luò)天青S、次氯酸鹽-硫胺素及蛋白藍(lán)670法測定蛋白質(zhì)的 方法，其靈敏度較低。熒光法金屬離子-染料結(jié)合法 金屬離子-染料和蛋白質(zhì)在適宜條件下反應(yīng)進(jìn)而檢測蛋白質(zhì)。例如鈦

7、-4,5-二溴基熒光銅-tween-80與蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)來測定微量尿蛋白。免疫學(xué)方法免疫擴散發(fā)法瓊脂糖免疫電泳法毛細(xì)管電泳免疫法比活性介紹 鄒運 3097119049每個質(zhì)量單位所含活性單位的數(shù)目。如每毫克蛋白質(zhì)所含酶單位數(shù)， 每千克蛋白質(zhì)所含開特數(shù)， 每微摩爾所含微居里數(shù)。比活性（SA）1標(biāo)記分子中標(biāo)記放射性的相對強度或非放射性標(biāo)記物(如酶標(biāo)記物)相對活性的表示方法。一般以單位質(zhì)量所含放射性核素量(如d/m、Bq 或所測得的放射性記數(shù)率)或酶的活性單位(如 U)等表示。 比活性（SA）2Concept酶的比活性：用每毫克蛋白所具有的酶活性來表示。酶活性單位：根據(jù)國際酶學(xué)委員會規(guī)定：在特定情

8、況下，1min 使1mol底物轉(zhuǎn)變所需的酶量，稱為一個酶活性單位。 每毫升樣品中蛋白質(zhì)的毫克數(shù)；每毫升樣品中酶活性 單位數(shù)。酶的比活性Concept磷酸苯二鈉法：選用不同濃度的磷酸苯二鈉為底物，在AKP的 作用下。磷酸苯二鈉產(chǎn)生游離苯酚和磷酸鹽。苯酚在堿性條件 下與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化可生成紅色醌類復(fù) 合物。 用分光光度法測量酶活性。一、AKP酶活性的測量+ H2OAKP+K3Fe(CN)6堿性條件磷酸苯二鈉苯酚苯酚4-氨基安替比林醌類衍生物（紅色）如書本P129表4-1操作。室溫后10min，在分光光度計510nm處以空白管校正吸光度值為零。各管酶活性單位（U/ml）=測定管

9、A510/標(biāo)準(zhǔn)管A510*0.07*稀釋倍數(shù)紫外分光光度法：蛋白質(zhì)分子通常含色氨酸和酪氨酸，在波長 280 nm有最大吸收，可用經(jīng)驗公式計算蛋白質(zhì)含量。二、蛋白質(zhì)的定量測量經(jīng)驗公式蛋白質(zhì)含量C（mg/ml）=（1.55A280-0.76A260）*稀釋倍數(shù)AKP比活性單位（U/mg）=AKP比活性計算酶Km的測定Km的定義酶促反應(yīng)達(dá)到最大速度一半時底物的濃度測定Km的一種方法：雙倒數(shù)法SVVmax當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時Km值的推導(dǎo)KmS Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 雙倒數(shù)作圖法

10、(double reciprocal plot)，又稱為 林-貝氏(Lineweaver- Burk)作圖法 VmaxS Km+SV = （林貝氏方程） + 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 兩邊同取倒數(shù) 測定Km過程中條件的控制酶Km測定條件的選擇和限定引言中已強調(diào)：僅在一定條件下酶反應(yīng)速度v才和酶量成正比一定條件是什么？國際臨床化學(xué)聯(lián)合會（ifcc）和不少國家包括我國的一些學(xué)會建立了或正在建立測定酶活性濃度的推薦或參考方法。都毫無例外地提出測酶活性濃度方法所選擇的測定條件應(yīng)是酶反應(yīng)的“最適條件”以保證酶具有最大的催化活性。我國檢驗學(xué)會文件中對最適條件是這樣提出：選合適的底物、輔因

11、子、活化劑、變構(gòu)劑的種類和濃度。指示酶和輔助酶的種類和濃度。反應(yīng)混合液的最適ph，緩沖液種類和濃度。其它影響酶活性的因素，如去除各種抑制劑。一、底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類和濃度這一項包括幾種因子，其中最重要的是底物種類和濃度，這是每種測酶活性濃度方法中首先需要選擇的項目，選擇恰當(dāng)與否，對該酶測定至關(guān)重要。后面幾項則不是每種酶測定都會遇到的選擇。二、輔因子、活化劑的種類和濃度從廣義上說，凡能促進(jìn)酶及反應(yīng)物進(jìn)入活化狀態(tài)從而加速酶催化反應(yīng)的物質(zhì)都能稱為輔因子如測定酶需要輔因子，活化劑時，應(yīng)選擇合適的種類和濃度加入到測定酶的體系中，在些過程中可能會涉及到四類物質(zhì)首先是輔酶（coenzyme）。

12、很多酶反應(yīng)都必須有輔酶參加第二是輔基，輔基雖也是小的有機化合物，但卻是酶蛋白不可分割部分。不含輔基的酶蛋白稱為脫輔基酶蛋白（apoenzyme），沒有催化活性，必須加入足量輔基，和它結(jié)合成為全酶（holoenzyme），才可能有催化活性。第三類物質(zhì)是離子，很多酶需要特定離子幫助才能使其反應(yīng)達(dá)到最大速度。最常見的是二價金屬離子如mg2+、zn2+、mn2+、ca2+、fe2+等。所有轉(zhuǎn)移磷酸的酶，如激酶類和堿性磷酸酶的反應(yīng)都需要mg2+的參加。所以如在反應(yīng)體系中加入金屬螯合劑如ed-ta或以他們?yōu)榭鼓齽┏Ｒ种埔恍┟傅幕钚缘谒念愂且恍o法包括在前三類的其它加速酶反應(yīng)物質(zhì)。如巰基化合物可穩(wěn)定酶的雙硫鍵。在肌酸激酶反應(yīng)體系中加入它將明顯增高酶活性，并且隨所加巰基化合物的不同，增加的速度也有差異，所以在測肌酸激酶時要選擇好巰基化合物的種類