生化技術(shù)凝膠過濾

1、關(guān)于生化技術(shù)凝膠過濾第一張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 凝膠過濾是20C-60Y發(fā)展起來的一種分離純化方法；又稱分子篩層析、排阻層析原理：凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被阻擋在外部，從而使混合溶液中各種組分按分子質(zhì)量不同進行篩分特點：設(shè)備簡單，操作方便、重復(fù)性好、回收率高用途：分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素等，測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、樣品的濃縮和脫鹽等 第二張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月目 的掌握凝膠的分類和性質(zhì)掌握凝膠過濾的基本原理熟悉凝膠過濾的操作與應(yīng)用第三張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 凝膠的分類及性質(zhì) 第四張，PPT共七十頁，

2、創(chuàng)作于2022年6月 凝膠是一類不溶于水，但在水中有較大膨脹度和較好分子篩作用的化合物 目前主要有葡聚糖凝膠、天然瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂糖；其次，還有聚丙烯酰胺凝膠（生物膠）、交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰胺共聚凝膠，以及交聯(lián)瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合的凝膠等第五張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月商品名稱：Sephadex，由葡聚糖右旋糖酐(G型)和3-氯-1，2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)以醚鍵交聯(lián)而成 在交聯(lián)葡聚糖G-25、G-50中加入羥丙基后，即可構(gòu)成烷基化（LH型）葡聚糖凝膠 一、葡聚糖凝膠第八張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于

3、2022年6月第九張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月性狀：外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下可見表面為網(wǎng)狀皺紋溶解性：帶有大量的羥基，親水性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹 型號：Sephadex G-n（n越大，則交聯(lián)度越小，而膨脹度、吸水量和篩孔直徑則越大）應(yīng)用：1.理化性質(zhì)凝膠過濾層析：以G型Sephadex為固定相，水為流動相，對水溶性物質(zhì)進行分離凝膠滲透層析：以LH型Sephadex為固定相，以有機溶劑為流動相，對脂溶性物質(zhì)進行分離第十張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中是穩(wěn)定的、不溶解的 強酸或氧化劑溶液中，則容易使糖苷鍵

4、水解斷裂 在室溫下長期保存時，應(yīng)加入適量的防腐劑如CHCl3、0.05NaN3或20EtOH等 2.穩(wěn)定性第十一張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月含少量的羧基基團，為弱酸性物質(zhì)。能與帶正電荷的分離物如堿性蛋白質(zhì)等發(fā)生吸附克服方法：提高洗脫液的離子強度至0.05以上，可克服此非特異性吸附 常用含有NaCl的緩沖液作洗脫液。新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖然吸附的數(shù)量較少，但在定量測定或者分離純化極難得到的物質(zhì)時，也需先用易得到的蛋白質(zhì)進行預(yù)層析，以便消除其影響 3.吸附性第十二張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜環(huán)化合物以及某些凝集素具有較

5、強的吸附作用，若采用凝膠過濾層析分離它們時，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理 第十三張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的一種由D-半乳糖和3,6脫水的L-半乳糖連接而成的多糖。其商品名因生產(chǎn)廠家不同而異瑞典、中國 ：Sepharose美國：Bio-gel A 15m，排阻分子量小于15million的分子，即15 106 （排阻限度） 英國：Segavac，粉狀、顆粒狀丹麥：Gelarose除Segavac外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售 二、瓊脂糖凝膠第十五張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.性 質(zhì)高溫時

6、呈液態(tài)，經(jīng)凝集即成瓊脂糖凝膠對尿素、鹽酸胍等具有較強的抵抗力，在pH4.09.0緩沖液中穩(wěn)定層析流速較高干膠易脫水破裂，一般存放于含防腐劑的水溶液中，避免劇烈攪拌第十六張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月Sepharose 2B(2)、4B(4)和6B(6) Sepharose 6B的機械強度大于2B，但是篩孔小于2B Sepharose與1，3-二溴異丙醇(1,3-dibromopropanol)在強堿性條件下反應(yīng)后，即生成CL型交聯(lián)瓊脂糖 ( Sepharose CL） 這種瓊脂糖的篩孔與同濃度的、未交聯(lián)的瓊脂糖相同，但耐熱、耐酸堿。但是在氧化劑存在下，會有少量的多糖鏈發(fā)生解聚（穩(wěn)定性

7、提高） 2.應(yīng)用形式（按濃度分）第十七張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月3.特 點 機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好；且層析時流速較快第十八張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月商品名稱：Bio-gel（生物膠）。以甲撐雙丙烯酰胺(雙體)作交聯(lián)劑，以過硫酸銨作催化劑，在N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下（化學(xué)催化），將丙烯酰胺(單體)聚合而成 當改變單體濃度時，就可得到吸水率不同的產(chǎn)物。商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio-gel P-2到P-300，其阿拉伯數(shù)字表示排阻限度 如 Bio-gel P-150的排阻限度為小于150 103 Da三、聚丙烯酰胺凝膠第十

8、九張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 聚丙烯酰胺凝膠一般制成珠狀顆粒，使用前必須溶脹。能忍受濃的鹽、尿素和胍鹽等溶液的浸泡；耐酸堿，但要避免長期與強酸和強堿接觸，如果與其接觸并在高溫條件下，酰胺基將迅速發(fā)生分解 聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象 克服吸附的方法：提高洗脫液的離子強度 第二十張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成。此凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團耐酸堿、耐去污劑、耐解離劑，甚至可用去污劑、鹽酸胍或尿素溶液作洗脫劑 多用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖的分離純化，也用

9、于病毒顆粒的分離四、Sephacryl第二十一張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 由高交聯(lián)度的瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成特點：具有良好的分子篩特性和理化穩(wěn)定性。溶液的酸堿度可在pH312范圍內(nèi)變化；溶液中加入去污劑(如1SDS)和(或)解離劑(如8mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍)時，也不會影響分離效果 五、Superdex第二十二張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月Superose：高交聯(lián)度的多孔瓊脂糖珠玻璃珠：有大量的網(wǎng)孔，且分布均一。機械性能良好，在較高的層析流速下，分辨率并不受影響，其缺點是對蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附能力聚苯乙烯凝膠五、其 他第二十三張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于20

10、22年6月第二節(jié) 基本原理第二十四張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、基本原理 凝膠過濾層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑較一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而小分子化合物則可以在篩孔中自由擴散和滲透。某種組分凝膠層析柱中被排阻的程度用 表示 洗脫體積； 外水體積； 凝膠床體積 在一定層析條件下， 和 均為固定值，而 隨著被分離物分子量的變化而變化。組分分子量越大，則洗脫更容易（排阻越多）， 越小， 越小第二十五張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 各組分間的 值差異越大，分離效果越好； 差異越小,則分離效果很差，或根本無法分離

11、流出物用部分收集器等量或等時收集，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，得到分子量不同的各種組分第二十六張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、當Kav=0時，則Ve=Vo ，即對于根本不能進入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)全排阻，洗脫體積等于空隙體積即外水體積（圖中組分） 2、當Kav=1時，Ve=Vo+Vi 。即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)為空隙體積與內(nèi)水體積之和。Ve=Vo+Vi （圖中組分） 第二十七張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、當0Kav1時，Ve=Vo+ Kav（Vi Vg ）。表示固定相中只有一部分可被組分擴散滲入，一部分被排阻，Ve即在Vo與Vo+ViVg之間

12、變化（圖中組分）4、有時Kav1，表示凝膠對組分有吸附作用 （從內(nèi)水中洗脫出來的含量下降），此時VeVo+ViVg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25中的洗脫體積遠超出理論計算的最大值第二十八張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、 值的測定只要測出 、 和 ，即可計算出 值 的測定：（1）計算法： （2）測定法：第二十九張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 的測定：用藍色的葡聚糖2000（M=200萬），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的顏色，采用肉眼或分光光度計檢測（210、260或620nm）洗脫體積 的測定：用 、N-乙酰酪

13、氨酸或其他小分子物質(zhì)作為洗脫對象。由于分子量小，且無吸附，故洗脫體積剛好是 （ =1）當分子大小在凝膠孔徑的上、下限之間時，則 介于 和 之間（即 =0 1） 第三十張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 操 作第三十二張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）凝膠的選擇 1.型號：凝膠型號不一樣，篩分范圍亦不相同如：Sephadex G 型多用于分離蛋白質(zhì)； 生物膠和 Sephacryl等多用于分離核酸； 要除去蛋白質(zhì)中的鹽類，多用Sephadex G-252.粒度：粒度與交聯(lián)度無關(guān)。與粗顆粒相比，細顆粒凝膠之間空隙小，裝柱易均勻，

14、分離效果好，但流速慢；而粗顆粒凝膠流速快，宜用小顆粒直徑的層析柱 一、凝膠的選擇與處理第三十三張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）凝膠用量計算 由于凝膠在處理過程中會有一部分損失，故用此法計算出的凝膠用量需增加1020%第三十五張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）凝膠的處理 將所用的干膠置于510倍量的D.W中，充分浸泡（表6-2溶脹時間），用傾斜法去除表面懸浮的小顆粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室溫浸泡0.5h，抽濾除去堿液，用D.W洗至中性。再用抽氣方法以D.W或平衡液除去凝膠顆粒之間的氣泡第三

15、十六張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月1柱子的選擇當直徑相同時，柱長長者比柱長短者分辨率高柱長相同時，直徑大者比小者分辨率高床體積相同時，柱長長者比短的分辨率高一般理想的層析柱直徑與長度之比是1：251：100；層析柱外面最好有夾套，能控制溫度（柱溫箱） ，以保證結(jié)果的重復(fù)性 2裝柱：常用濕裝法（第三章）3凝膠柱的鑒定 二、凝膠柱的制備第三十七張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月流速、柱長對分離的影響 第三十八張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 加樣量與層析柱床體積及檢測方法的靈敏度有關(guān)。床體積越小、方法靈敏度越高時，加樣量越少 層析的目的在于分析時，加樣量占床體積的12 ，作

16、制備、脫鹽用時，占2030 一般來說，加樣量越少，分辨率越高。具體加樣體積由分配系數(shù)(Kav)或洗脫體積(Ve)來決定三、加樣與洗脫（一）加 樣第三十九張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 VeA、VeB：組分A、B的洗脫體積 KavA、KavB：組分A、B的分配系數(shù) Vs：A、B兩組分的洗脫體積之差（又稱為分離體積）Vs= VeA VeB當樣品體積VpVs時，理論上的洗脫圖形是兩種物質(zhì)恰好分開(圖中)。但由于樣品流過柱時的擴散作用，其體積會逐漸增大，致使其洗脫體積遠比原來大加樣量（Vp）的確定第四十一張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月

17、圖、 中A、B兩種物質(zhì)有一定程度的交叉，這表明二者只是部分分開。因此，當Vp等于或大于Vs時，A、B兩種物質(zhì)就不能完全分開(圖中) 當VpVs時，A、B兩種物質(zhì)就能分開(圖中) 根據(jù) Ve = Vo + Kav（Vt Vo） 又 Vs = VeAVeB = （ KavAKavB ）（Vt Vo）第四十二張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 Vs = （ KavAKavB ）（Vt Vo） = （ KavAKavB ）（Vi +Vg） A、B兩種物質(zhì)能分開的最低限：VpVs最大Vs時的必要條件：KavAKavB 最大，為101 Vi +Vg最大，一般為Vt/2則：最大理論加樣量VpVsVt/

18、2最大理論加樣量的計算第四十三張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 為提高分離效果，除了縮小加樣體積以外，樣品的黏度也一般以小于2cp(厘帕，P= N/m2s)，或者與洗脫液的黏度相當為宜 葡聚糖使粘度上升 黏度的影響第四十四張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月粘度對柱層析的影響 第四十五張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.洗脫液的選擇原則 能溶解被洗脫物質(zhì)而又不使其變性或失活 一般以單一緩沖液（如PBS、Tris-HCl緩沖液等）或鹽溶液，有時甚至用D.W作為洗脫液 2.洗脫速度 若流速不均勻，收集的每一部分洗脫體積不恒定，Kav就難以確定 最好的裝置是恒流泵(微量泵、蠕動泵

19、)，可以使流速在較大范圍內(nèi)恒定。若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進行，其裝置可使用恒壓瓶 一般，洗脫速度慢，分離效果就好；但若太慢，又會因擴散加劇而影響分離效果(二)洗 脫第四十六張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月。第四十七張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月Sephadex G-50及其以下（交聯(lián)度大）的流速與操作壓之間的關(guān)系遵守Darcys規(guī)律u：線性流速(ml/cm2h)K：常數(shù)(粗、中、細顆粒的各不相同)P：操作壓(cp)L：柱長流速與操作壓第四十八張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 Ko僅與凝膠的性質(zhì)有關(guān)，而與柱子直徑基本無關(guān)。 但是G-75以上各種型號交聯(lián)葡聚糖的流

20、速還與柱直徑大小有關(guān) 當洗脫液的黏度為lcp時的表達式第四十九張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 一般，洗脫流速慢，則分離效果就好；但太慢又會因擴散加劇而影響分離效果第五十一張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、凝膠柱的再生及保存（一）再生 使用過一次或幾次的凝膠柱，通常用34倍床體積的洗脫液沖洗，再用平衡液平衡即可；但使用過多次后，凝膠床體積變小、流動速度下降、雜質(zhì)過多等，其處理方法是 先用水反復(fù)進行逆向沖洗（反沖），再用緩沖液進行平衡； 把凝膠倒出，用低濃度的酸或堿按其預(yù)處理方法進行處理，然后重新裝柱第五十二張，PPT共七十頁，創(chuàng)作

21、于2022年6月膨脹狀態(tài) 即在水相中保存?？杉尤?.02%的疊氮鈉（NaN3）溶液等防腐劑或加熱滅菌后于低溫短時間保存。 一般不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑。因為它們能引起凝膠顆粒的收縮，同時還能進入層析儀器的塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果（二）保 存第五十三張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十四張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月半收縮狀態(tài)： 用完后水洗凈，然后再用60% 70%乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫較長時間保存干燥狀態(tài)： 用水洗凈后，加入含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗，則凝膠脫水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽濾至干，于6080烘干后長時間保存不脫水

22、而直接烘干會黏結(jié)成塊第五十五張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 應(yīng) 用第五十六張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：鹽類小分子物質(zhì)進入凝膠篩孔，而大分子物質(zhì)則被排阻在外（分子篩原理）優(yōu)點：與透析相比，速度快，不會引起大分子物質(zhì)變性材料：細顆粒葡聚糖凝膠G-25 一、脫鹽和濃縮第五十七張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月分離對象：溶解度、帶電性等理化性質(zhì)相似而分子質(zhì)量不 同，或者是聚合度不等的混合物溶液實例：Sephadex G-200層析純化AFP 制備Ag-Ab復(fù)合物 溶于少量0.1mol/L Gly-HCl緩沖液中，并用本液透析2h 上Sephadex G-200柱

23、 得AFP峰 置0.1mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH4.8）透析 上柱洗脫 AFP純品二、分離生命物質(zhì)第五十八張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十九張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月熱源物質(zhì)：指微生物產(chǎn)生的分子量很大的某些多糖蛋白復(fù) 合物等，能使人體發(fā)熱的物質(zhì)材料：Sephadex G-25（80120目 ） 特點：比活性炭吸附、離子交換吸附等方便 實例：用Sephadex G-25凝膠層析除去氨基酸粗品中的熱源質(zhì)：利用熱源（大分子蛋白類）的Kav=0，而氨基酸的Kav1，將試劑量控制在柱體積的2030%，能實現(xiàn)完全分離三、去熱源物質(zhì)第六十一張，PPT共七十頁，創(chuàng)作于2022年6月 原理： Kav = b lgM + c 或lgM = adKa