乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測

1、 1醫(yī)院檢驗(yàn)科 PCR室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：ABCD-3-PR-28版本/修訂號：A/0主題內(nèi)容乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測生效日期：20060808 第 PAGE 5 頁 共 NUMPAGES 5 頁乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測目的：保證HBV DNA檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。適用范圍：HBV DNA的TaqMan熒光定量檢測，標(biāo)本類型為血清。負(fù)責(zé)人：1 操作人：1 1 1 原理：本試劑盒用一對乙型肝炎病毒特異引物和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，再用PCR體外擴(kuò)增法檢測丙型肝炎病毒cDNA。性能參數(shù)：檢出低值1103基因拷貝

2、/ml。標(biāo)本要求：（1）標(biāo)本類型：血清。（2）標(biāo)本采集：見標(biāo)本采集手冊。（3）標(biāo)本儲存和運(yùn)輸：室溫放置不超過8小時，4-8不超過72小時，-20保存期6個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫運(yùn)輸。（4）標(biāo)本拒收狀態(tài)：細(xì)菌污染、嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不能作測定。容器和添加劑類型：無菌離心管和無菌真空管所需設(shè)備：ABI GeneAmp 5700、臺式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4、-20）、生物安全柜、紫外燈試劑：DNA提取液（500l/管）2管；HBV-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管）20管；陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1108基因拷貝/ml）（50l/管）1管；陰性質(zhì)控品（250l/管）1管。校準(zhǔn)程序（計量學(xué)溯源性）：送深圳

3、市計量檢測所校準(zhǔn)。程序步驟:：11.1標(biāo)本處理：取血清標(biāo)本40l，加等量DNA提取液打勻。（提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。）沸水浴10分鐘（誤差不超過1分鐘），（為保證病毒顆粒充分裂解可轉(zhuǎn)至4靜置812小時）。10000rpm離心5分鐘，取上清2l做PCR反應(yīng)。11.2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋和處理：將陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1108基因拷貝/ml）6000rpm離心數(shù)秒標(biāo)示為108，另取4支滅菌新0.5ml離心管，分別加入45l陰性質(zhì)控品，依次標(biāo)示為107104。吸取108管5l至107管

4、，用加樣器反復(fù)混勻后換新吸頭取5l至106管，依次方法稀釋至104管。-20保存；分別吸取稀釋好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度和陰性質(zhì)控品管各40l，加等量DNA提取液打勻，以下步驟同上處理。11.3PCR擴(kuò)增：取HBV-PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后的樣品管或陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品2l，6000rpm離心1分鐘。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品，陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品梯度以及未知標(biāo)本，并設(shè)置樣品名稱，標(biāo)記熒光基團(tuán)種類和循環(huán)條件：ABI GeneAmp 5700的循環(huán)條件：932分鐘預(yù)變性，然后按9345秒5560秒，先做10個循環(huán)，最后按9330秒5545秒，做30個循環(huán)。所有設(shè)

5、置全部完成后保存文件，最后運(yùn)行程序。11.4結(jié)果分析條件的設(shè)定：ABI GeneAmp 5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖象調(diào)節(jié)baseline的start值（24），stop值（79）以及Threshold值，使Std curve窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到最佳（correlation數(shù)值介于-0.97-1之間，correlation數(shù)值等同于|r|），最后到Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的未知標(biāo)本數(shù)值（Qty）。質(zhì)量控制程序：陰性質(zhì)控品：全部陰性 陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品：全部陽性 r0.97(correlation 數(shù)值介于-0.97-1); 108至104基因拷貝/ml的陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測的定量值與理論值相比誤差小于300%。干擾（如乳糜血、溶血、膽紅素血）和交叉反應(yīng)：乳糜血、溶血、膽紅素血基本不影響本實(shí)驗(yàn)的測定。生物參考區(qū)間：正常人樣本為陰性或0基因拷貝/ml?；颊邫z驗(yàn)結(jié)果的可報告區(qū)間：Ct值40，實(shí)驗(yàn)樣本的HBV DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）=M；Ct值=40，樣品 HBV DNA含量1