細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù).吉文匯

1、細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)一、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查法油鏡的使用及細(xì)菌基本形態(tài)的觀察細(xì)菌抹片的制備與染色二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定培養(yǎng)基的制備與無菌器材的準(zhǔn)備細(xì)菌的分離培養(yǎng)與無菌操作接種技術(shù)細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)檢測分子生物學(xué)鑒定三、藥物敏感試驗(yàn)四、病原菌的微生物學(xué)檢查 一、細(xì)菌基本形態(tài)觀察（一）油鏡的使用普通光學(xué)顯微鏡機(jī)械裝置反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推動(dòng)器、粗動(dòng)螺旋、微動(dòng)螺旋等光學(xué)系統(tǒng)是一種放大倍數(shù)較高（95100倍）的物鏡一般都刻有放大倍數(shù)（如95、100等）和特別的標(biāo)記，以便于認(rèn)識(shí)。國產(chǎn)鏡多用油字表示，國外產(chǎn)品則常用Oil（Oil Immersion）或HI（Homo

2、geneous Immersion）作記號(hào)。油鏡上也常漆有黑環(huán)或紅環(huán)油鏡的鏡身較高倍鏡和低倍鏡為長，鏡片最小，這也是識(shí)別的另一個(gè)標(biāo)志。 檢查細(xì)菌標(biāo)本多用油鏡進(jìn)行1、什么是油鏡？空氣玻璃油光源2、油鏡的原理（2）油鏡頭與栽玻片之間為空氣所隔時(shí)，光線經(jīng)聚光器，通過載玻片進(jìn)油鏡時(shí)，由于空氣介質(zhì)和玻璃介質(zhì)的折射率不一樣，光線因折射而損失，使視野更暗。（3）在載玻片和油鏡之間加上和玻璃折光系數(shù)相同的香柏油，光線直接進(jìn)入鏡頭，不發(fā)生折射，視野明亮，便于觀察。（1）油鏡頭的晶片細(xì)小，進(jìn)入鏡中的光量亦較少，其視野較高倍鏡為暗。3、油鏡的使用方法（1）對光采取最強(qiáng)亮度（升高集光器，開大光圈，調(diào)好反光鏡等）不可直

3、對陽光（2）滴油標(biāo)本上有菌影的地方滴1滴柏木油，切勿過多（3）標(biāo)本放置或移置載物臺(tái)正中，轉(zhuǎn)換油鏡頭，鏡頭浸入油滴中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本面接觸為度。不應(yīng)接觸慢慢降低油鏡頭（4）左眼由接目鏡注視鏡內(nèi)，同時(shí)慢慢旋動(dòng)粗螺旋提起鏡筒，至能模糊看到物象時(shí)，再轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)螺旋，直至看清晰為止此時(shí)嚴(yán)禁用粗螺旋降下油鏡筒注意鏡頭離開油，就不能看清，重新按上述的步驟進(jìn)行。4、油鏡使用過后（1）立即用擦鏡紙擦拭鏡頭，如油漬已干，則須用擦鏡紙蘸少許二甲苯溶解并拭去油漬，再用干凈擦鏡紙擦去二甲苯。（2）將顯微鏡各部還原，聚光器下降，反光鏡垂直于鏡座，鏡頭轉(zhuǎn)成八字形，以免與聚光器發(fā)生碰撞。 （3）最后用柔軟紗布清潔載物臺(tái)等機(jī)械

4、部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。5.細(xì)菌基本形態(tài)觀察球菌：單球、雙球、 鏈球、葡萄球菌桿菌：短桿、長桿、棒桿、梭桿等。螺菌：弧菌、螺旋菌、螺旋體等。(1)球菌 鏈球菌：注意其鏈狀排列，鏈的長短，個(gè)體的形態(tài)。 葡萄球菌：注意其無一定次序，無一定數(shù)目，不規(guī)則地堆放在一起的形態(tài)。氣球菌 Aerococcus白聯(lián)球菌Leuconostoc片球菌Pediococcus消化鏈球菌 Peptostreptococcus葡萄球菌 Staphylococcus鏈球菌Streptococcus(Hemoculture)(2)桿菌 單桿菌：注意其單個(gè)散在的狀態(tài)，菌體外形、大小，菌端的形態(tài)。 雙桿菌：注意其成雙的

5、排列以及菌體外形、大小，菌端的形態(tài)。 鏈桿菌：注意其成鏈狀的排列，鏈的長短，菌體的外形、大小，菌端的形態(tài)。大腸桿菌 E.coli大腸桿菌 E.coli沙門氏菌 Salmonella.sp布氏桿菌Bacterium burgeri 銅鋁假單胞桿菌（綠膿桿菌）炭疽桿菌 anthrax Bacillus蠟樣芽孢桿菌 Cerea bacillus枯草桿菌Bacillus subtilis產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens乳酸桿菌lactobacilli結(jié)核桿菌Tbc (SEM)枯草芽孢桿菌Bacillus subtili

6、s (SEM)沙門氏菌salmonella(SEM)大腸桿菌(SEM)單核細(xì)胞增生性李氏桿菌(SEM)產(chǎn)氣莢膜梭菌(SEM)炭疽繁殖體(SEM)空腸彎曲桿菌(SEM)雙歧桿菌(3)螺旋狀菌 弧菌：注意其彎曲成弧形以及菌體大小，菌端的形態(tài)。 螺菌：注意其具有兩個(gè)彎曲以上的螺旋狀及菌體的長度、大小，菌端的形態(tài)。 梅毒螺旋體Microspironema pallidum鉤端螺旋體特殊結(jié)構(gòu): 莢膜芽孢鞭毛異染顆粒破傷風(fēng)芽孢桿菌 Bacillus tetani（二）細(xì)菌的抹片制備與染色 細(xì)菌個(gè)體微小，無色而半透明，折光性弱，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察活細(xì)胞時(shí)，只能見其大致輪廓。制成抹片和染色后，則能較清楚地

7、顯示細(xì)菌的形態(tài)及某些構(gòu)造。還可根據(jù)細(xì)菌呈現(xiàn)出的不同顏色反應(yīng)而對其進(jìn)行鑒別。 原理1、細(xì)菌抹片的制備（1）玻片準(zhǔn)備載玻片應(yīng)清晰透明，潔凈而無油漬，滴上水后，能均勻展開，附著性好。滴95%酒精23滴，用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈火焰上輕輕拖過幾次。若仍不能去除油漬，可再滴12滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕拖過如有殘余油漬，可按下列方法處理：（2）抹片切忌涂片太厚，否則不利 于染色和觀察。所用材料不同，抹片的方法有差異液體材料：液體培養(yǎng)物、血液、滲出 物、 乳汁等。 直接用滅菌接種環(huán)勾取1環(huán)材料，于玻片中央涂抹于玻片上即可。但要注意將管底沉淀物搖勻，以免影響涂片效果。固體培養(yǎng)物 用經(jīng)酒精

8、燈火焰燒過的接種環(huán)，蘸取生理鹽水2環(huán)于清潔無油脂的載玻片中央，再勾取細(xì)菌的固體培養(yǎng)物少許混于生理鹽水中，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。組織涂片 用滅菌的剪刀、鑷子取被檢組織一小塊，以其斷面在玻片上壓印或涂抹成適當(dāng)大小的薄片。如為膿汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。(3)干燥 將抹片置于空氣中讓其自然干燥。 (4)固定 有兩種方法： 火焰固定 將已干燥的抹片菌膜向上，以鐘擺速度在酒精燈火焰上通過數(shù)次（以不燙手背為宜）。 化學(xué)固定 加數(shù)滴甲醇于玻片上，固定2-3分鐘，自然揮發(fā)干燥。抹片如做瑞氏染色，則不必先做固定，染料中含有甲醇，可以達(dá)到固定的目的。 固定的目的 :除去抹片上的水分，使菌體蛋白附著在

9、載玻片上，以防染色過程中被水沖掉。 使抹片易于著色，變性的蛋白質(zhì)著色力強(qiáng)。 能殺死抹片中的部分微生物。2、細(xì)菌常用染色法（1）簡單染色法 只用一種染料進(jìn)行染色的方法。只能顯示出細(xì)菌的外形，大小及排列。 美藍(lán)染色法原理：細(xì)菌菌體蛋白的等電點(diǎn)多偏酸性（pH2.0-5.0），而細(xì)菌生活環(huán)境的pH在7.0左右，此時(shí)，細(xì)菌菌體（在中性環(huán)境中）帶負(fù)電荷，極易與堿性美藍(lán)染料結(jié)合而呈藍(lán)色。方法：在已固定好的抹片上，滴加適量（足夠覆蓋涂抹點(diǎn)即可）的美藍(lán)染色液，經(jīng)12min，水洗，干燥（可用吸水紙吸干，或自然干燥，但不能烤干），鏡檢，菌體呈藍(lán)色。 (2)革蘭氏染色法 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的重要鑒別染色法

10、，通過此法染色，可將細(xì)菌鑒為革蘭陽性菌 和革蘭氏陰性菌 兩大類。 G+G-革蘭氏染色原理利用細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同 四種染料 四個(gè)步驟 初染堿性染料 (草酸銨結(jié)晶紫溶液)1-3min水洗 媒染媒染劑 (碘液)其作用是增強(qiáng)染料與菌體的親和力，加強(qiáng)染料與細(xì)胞的結(jié)合1-2min水洗 脫色0.5-1min水洗 脫色劑(乙醇)將染料溶解，使被染色的細(xì)胞脫色，利用不同細(xì)菌對染料脫色的難易程度同，而加以區(qū)分。復(fù)染復(fù)染劑(蕃紅溶液)使經(jīng)脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色的細(xì)菌進(jìn)行比較10-30s水洗 干燥后鏡檢觀察 附帶載玻片 的革蘭氏染色法 (3)抗酸性染色法 分枝桿菌屬細(xì)菌其細(xì)胞壁含有大

11、量脂質(zhì)，主要是分枝菌酸 ，一般不易著色，如果經(jīng)加溫或延長染色時(shí)間而著色后能抵抗強(qiáng)脫色劑鹽酸酒精的脫色，所以又稱抗酸桿菌。 用普通染色法不被著色，需在加熱條件下與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合形成復(fù)合物。而且用酸性乙醇處理不能使其脫色，故菌體染成紅色。此染色法是鑒別分枝桿菌屬的染色法萋-尼（Ziehl-Neelsen）氏染色法首先在已干燥、固定好的抹片上滴加較多的石炭酸復(fù)紅染色液，在玻片下以酒精燈火焰微加熱至產(chǎn)生蒸汽為度（不要煮沸），維持微微產(chǎn)生蒸汽35min，水洗。然后用3鹽酸酒精脫色，至標(biāo)本無色脫出為止，充分水洗。再用堿性美藍(lán)染色液復(fù)染約1min，水洗。最后吸干，鏡檢。 抗酸性細(xì)菌呈紅色非抗酸性細(xì)菌呈藍(lán)

12、色溫染（石炭酸復(fù)紅溶液） 5 min脫色（3%鹽酸酒精溶液） 0.5-1 min復(fù)染（堿性美蘭溶液） 0.5 min水洗，干燥，鏡檢結(jié)核桿菌（抗酸染色）(4)瑞氏染色法瑞氏染料是美藍(lán)與酸性伊紅鈉鹽混合而成，當(dāng)溶于甲醇后即發(fā)生分離，分解成酸性和堿性兩種染料。由于細(xì)菌帶負(fù)電荷，與帶正電荷的堿性染料結(jié)合而成藍(lán)色。組織細(xì)胞的細(xì)胞核含有大量的核糖核酸鎂鹽，也與堿性染料結(jié)合成藍(lán)色。而背景和細(xì)胞漿一般為中性，易與酸性染料結(jié)合染成紅色（瑞氏染色液中一般含有甲醇，故組織標(biāo)本的瑞特氏染色時(shí)，一般不需要固定）。常用的瑞氏染色方法有以下兩種:（1）抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于其上，為了避免很快變干，染色液可適當(dāng)多

13、加些，或看情況補(bǔ)充滴加；經(jīng)13min，再加約與染色液等量的中性蒸餾水或緩沖液，輕輕晃動(dòng)玻片（或用嘴輕輕吹勻），使之與染液混合均勻，經(jīng)5min左右，直接用水沖洗（注意：不可將染料先傾去），吸干或烘干，鏡檢。（2）抹片自然干燥后，按抹片點(diǎn)大小蓋上一塊略大的清潔濾紙片，在其上輕輕滴加染色液，至略浸過濾紙，并視情況補(bǔ)滴，維持不使變干；染色35min，直接以水沖洗，吸干或烘干，鏡檢。此法的染色液經(jīng)濾紙濾過，可大大避免沉渣附著抹片上而影響鏡檢觀察。細(xì)菌染色成藍(lán)色組織細(xì)胞的細(xì)胞漿呈紅色 細(xì)胞核呈藍(lán)色 (5)姬姆薩染色法于5mL新煮過的中性蒸餾水中滴加510滴姬姆薩氏染色液原液，即稀釋為常用的姬姆薩氏染色液。

14、 抹片經(jīng)甲醇固定干燥后，在其上滴加足量染色液或?qū)⒛ㄆ胧M染色液的染缸中，染色30min，或者染色數(shù)小時(shí)至24h，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。 細(xì)菌呈藍(lán)青色組織細(xì)胞胞漿呈紅色細(xì)胞核呈藍(lán)色(6)其他染色法芽孢染色法復(fù)紅美藍(lán)染色法孔雀綠-沙黃染色法 莢膜染色法美藍(lán)染色法 瑞氏染色法或姬姆薩氏染色法 節(jié)氏（Jasmin）莢膜染色法 鞭毛染色法 萊氏（Leifson）鞭毛莢膜染色法劉榮標(biāo)氏鞭毛染色法 卡-吉二氏（Casares-Cill）鞭毛染色法 銀染法 異染顆粒染色法 美藍(lán)染色法 亞氏（Albert）染色法 注意事項(xiàng)1在制備細(xì)菌抹片時(shí)，應(yīng)注意無菌操作，尤其是接觸到病原菌時(shí)，需防止細(xì)菌污染環(huán)境及操

15、作者。2細(xì)菌抹片玻片準(zhǔn)備時(shí)，應(yīng)注意是否有油漬。如有油漬應(yīng)及時(shí)處理，否則玻片上的細(xì)菌抹片不能很好的均勻展開，將影響到細(xì)菌的觀察。3細(xì)菌抹片制備后，應(yīng)盡可能自然干燥。如果采用火焰干燥，不要過熱，一般采用手背試，以不燙手為度。4細(xì)菌抹片的固定，應(yīng)根據(jù)不同標(biāo)本的抹片，采用不同的方法。一般純培養(yǎng)物，常用火焰固定；而組織抹片常用化學(xué)方法固定。但瑞特氏染色法，不用專門固定，因?yàn)槿鹛厥先旧褐?，已含有甲醇?因在抹片中的固定，并不能保證殺死全部的細(xì)菌，也不能完全避免在染色水洗時(shí)不將部分抹片沖脫。所以，對于一些感染性較強(qiáng)的病原菌，特別是帶芽孢病原菌的抹片時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格慎重處理染色用過的殘液和抹片本身，以免引起病原的

16、散播。 二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定 細(xì)菌等病原菌的分離及鑒定，使傳染病診斷技術(shù)的基礎(chǔ)，也是一項(xiàng)很基本的確診方法。培養(yǎng)基的制備與無菌器材的準(zhǔn)備細(xì)菌的分離培養(yǎng)與無菌操作接種技術(shù)細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)檢測分子生物學(xué)鑒定(一)培養(yǎng)基的制備和無菌器材的準(zhǔn)備1、培養(yǎng)基培養(yǎng)基是按照微生物的生長要求配制成的一種人工營養(yǎng)制品，主要作為繁殖細(xì)菌微生物、分離細(xì)菌微生物，鑒定細(xì)菌微生物、保存和研究細(xì)菌微生物以及制造生物制品等用。概念按來源分： 天然培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基分類按物理性狀分： 固體培養(yǎng)基 純化，增菌 液體培養(yǎng)基 增菌 半固體培養(yǎng)基 動(dòng)力檢測，保種無動(dòng)力 有動(dòng)力半固體培養(yǎng)基（穿刺培養(yǎng)）固體培養(yǎng)基：

17、菌落，菌苔菌落: 指微生物細(xì)胞在一定條件下,在固體培養(yǎng)基表面形成的肉眼可見的微生物群體。若來自一個(gè)細(xì)胞,則為純培養(yǎng)或稱克隆。菌苔:大量細(xì)菌的菌落聯(lián)成一片。液體培養(yǎng)基：表面生長 均勻混濁生長 沉淀生長 按用途分： 普通培養(yǎng)基 增菌培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 厭氧培養(yǎng)基2、制備培養(yǎng)基培養(yǎng)基必須含有細(xì)菌所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白胨、碳水化合物及鹽類。培養(yǎng)基必須含有合適的水分，因?yàn)榧?xì)菌主要靠液體以彌散和滲透方式攝取營養(yǎng)。多數(shù)致病菌對酸堿值的變化均敏感，故所用的培養(yǎng)基需要調(diào)整pH值，通常為7.27.6。（1）培養(yǎng)基的制備要求制造的及分裝培養(yǎng)基的容器不應(yīng)含有抑制細(xì)菌生長繁殖的物質(zhì)，制造時(shí)最好用搪瓷鍋或

18、鋁鍋，不用通過或鐵鍋。制造培養(yǎng)所用的化學(xué)藥品，均需化學(xué)純以上，且各種成分要準(zhǔn)確稱量。制造的培養(yǎng)基應(yīng)均質(zhì)透明。培養(yǎng)基必須徹底滅菌，且應(yīng)雜檢。（2）制備培養(yǎng)基的操作步驟稱量調(diào)pH、過濾加塞、包扎高壓蒸汽滅菌溶解分裝形成培養(yǎng)基雜菌檢驗(yàn)冷藏待用稱量按培養(yǎng)劑配方稱好各種原料，培養(yǎng)基內(nèi)用的試劑藥品必須達(dá)到化學(xué)純或分析純，各種成分稱量必須準(zhǔn)確。溶解將各種成分按規(guī)定混合，加熱溶解。調(diào)節(jié)pH值用酸度計(jì)，pH試紙或用氫離子濃度比色計(jì)來矯正pH值。(可用1molL NaOH或1molL HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié))。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試

19、紙測試，直至達(dá)到所需pH為止，調(diào)整pH值到適宜的范圍后，再加熱煮沸1015min（注意補(bǔ)加液體的損耗）。過濾用濾紙或雙層紗布(中間夾一層脫脂棉花)趁熱過濾。分裝 根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管或三角燒瓶內(nèi)。液體：分裝以試管高度的1/4左右為宜。固體：每試管分裝量為管高的1/5(滅菌后制成斜面)；分裝三角燒瓶的量以不超過其1/2為宜。半固體：分裝試管一般以管高度1/3為宜(滅菌后制成斜面或垂直待凝成半固體深層瓊脂)。滅菌：高壓蒸汽滅菌高壓鍋的構(gòu)造及使用原理了解： 該法是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，加熱使滅菌鍋內(nèi)的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣內(nèi)的冷空氣排盡后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)

20、加熱，此時(shí)鍋內(nèi)溫度逐步升，高于100 。在高溫下，菌體蛋白質(zhì)變性而達(dá)到滅菌的目的。附加：高壓蒸汽滅菌滅菌操作步驟首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時(shí)旋緊相對的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。排空冷氣，使置于高壓鍋下層的物品達(dá)到設(shè)定的有效溫度開啟電源加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋

21、內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用 1.05 kg/ cm2 ，121.3 ，20 min滅菌。滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。 如果壓力未降到0時(shí)打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。形成培養(yǎng)基分裝好的液體培養(yǎng)基，取出后冷卻至溫。分裝好的半固體、斜面固體培養(yǎng)基，取出后按需要將試管斜置擺放，形成一定的角度，冷卻至室溫（如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)

22、垂直放置至冷凝）。平板的制作：將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50左右傾入無菌培養(yǎng)皿中，待冷凝。（溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板）平板的制作應(yīng)在酒精燈旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入1012mL的培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。 雜菌檢驗(yàn)，保存將上述冷凝后的培養(yǎng)基放入 37 溫箱培養(yǎng)24 h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可置于 4 冰箱冷藏，待用。 如果試驗(yàn)的精密度要求

23、不高， 一般情況下，無須進(jìn)行雜菌檢驗(yàn)。(3)培養(yǎng)基制作注意事項(xiàng)加熱溶解過程中，要不斷攪拌，以免瓊脂或其他固體物質(zhì)粘在燒杯底上燒焦，以致燒杯破裂。加熱過程中所蒸發(fā)的水分應(yīng)補(bǔ)足。pH值必須按各種不同培養(yǎng)基的要求準(zhǔn)確矯正。所用器皿要潔凈，勿用銅質(zhì)和鐵質(zhì)器皿。分裝培養(yǎng)基時(shí)，注意不得使培養(yǎng)基在瓶口或管壁上端沾染，以免引起雜菌污染。培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證殺菌效果和不損失培養(yǎng)基的必要成分。 (二)細(xì)菌的分離培養(yǎng) 與 無菌操作接種技術(shù)病料的采集和運(yùn)送病料處理細(xì)菌的分離與接種細(xì)菌的培養(yǎng)流 程無菌操作貫穿始終采樣所用器械應(yīng)事先消毒。對急性死亡的動(dòng)物，從耳尖或四肢末梢血管取血制成

24、涂片，染色鏡檢，在排除炭疽后方能剖檢取樣。為了提高病原微生物的陽性分離率，采取的病料要盡可能齊全，除了內(nèi)臟、淋巴結(jié)和局部病變組織外，還應(yīng)采取腦組織和骨髓，以防遺漏。認(rèn)真填寫好病料送檢單和剖檢病理變化記錄。病料的采集和運(yùn)送1.3.細(xì)菌的分離與接種 在細(xì)菌學(xué)診斷中，分離培養(yǎng)是不可缺少 的一環(huán)。 主要是在含許多細(xì)菌的病料或培養(yǎng)物中挑選出某種細(xì)菌。 選擇適合于所分離細(xì)菌生長的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、氣體條件等。同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按無菌操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并做好標(biāo)記。分離培養(yǎng)的目的分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意(1)平板分段劃線法操作前在平皿底面上用記號(hào)筆作好標(biāo)記，如菌種、接種日期等，字體盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當(dāng)中，以免

25、影響結(jié)果觀察（標(biāo)簽如果寫在皿蓋上，同時(shí)觀察兩個(gè)以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開皿蓋時(shí)，容易混淆。）另外，在平皿底面邊緣作一劃線標(biāo)記。右手取接種環(huán)在火焰上滅菌，先將環(huán)端燒熱，然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來回通過火焰數(shù)次。待燒灼的接種環(huán)冷卻后，取一接種環(huán)帶分離的細(xì)菌混合菌液。左手斜持(45度角)瓊脂平板，略開蓋，平板在酒精燈火焰左前上方約56cm距離。右手持已取標(biāo)本的接種環(huán)在瓊脂平板表面一側(cè)涂布于培養(yǎng)基邊緣，作為原劃線。接種環(huán)燒灼滅菌，冷卻后自原劃線末端沾取少許標(biāo)本，開始劃線，接種環(huán)與

26、平板表面成3040角，運(yùn)用腕力將接種環(huán)在平板上來回劃線。劃線要密但不能重疊，充分利用平板的表面積，不要?jiǎng)澠骗傊砻?，并注意無菌技術(shù)，避免空氣中細(xì)菌的污染。也可用分區(qū)劃線法，即從原劃線末端沾取標(biāo)本后只劃平板的1/51/4，劃畢燒灼滅菌接種環(huán)，待冷卻后(可接觸平板試之，如不融化瓊脂，即已冷卻)，于第二段處再作劃線，且在劃線時(shí)與第一段的劃線相交數(shù)點(diǎn)。待第二段劃線完成時(shí)，再上述方法滅菌，冷卻后同樣劃線，依次劃至最后一段。接種環(huán)燒灼滅菌后方可放下。將培養(yǎng)皿倒置(平板底部朝上)于37溫箱中，培養(yǎng)一定時(shí)間后取出觀察結(jié)果。 注意事項(xiàng) 在分離培養(yǎng)之前觀察菌落時(shí)，不要將空氣中落入培養(yǎng)基而生長的雜菌誤認(rèn)為目的細(xì)菌。

27、雜菌一般生長于劃線痕跡外，或?yàn)閭€(gè)別的形狀異常的孤立菌落。另外觀察時(shí)，也要注意保護(hù)好平板，勿使再落入雜菌。還應(yīng)注意下列事項(xiàng)：選擇適合于所分離細(xì)菌生長的培養(yǎng)基。病原細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般在37?？紤]所分離的細(xì)菌是需氧性或厭氧性，決定培養(yǎng)條件。初代分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，應(yīng)進(jìn)一步選擇可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。劃線時(shí)先將接種環(huán)稍稍彎曲，這樣易和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致劃破培養(yǎng)基。劃線中不宜過多重復(fù)舊線，以免形成菌苔。 (2)平板涂布培養(yǎng)法在培養(yǎng)基的平板底面分別用記號(hào)筆標(biāo)明待接種的菌種名稱、稀釋度、日期和接種者。用無菌吸管吸取0.1mL待分離菌液，小心滴在平板培養(yǎng)基表面中央位置(0.1mL的菌液要全部滴在培養(yǎng)基上，若吸

28、管尖端有剩余的，需將吸管在培養(yǎng)基表面上輕輕地按一下便可)。右手拿無菌涂棒，平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿一條直線輕輕地來回推動(dòng)，使之分布均勻，然后改變方向沿另一垂直線來回推動(dòng)，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次。室溫下靜置510min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基平板倒置于37溫箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察結(jié)果。(3)傾注平板法取6支無菌試管，標(biāo)明1、2、3、4、5和6號(hào)碼。用無菌吸管分別吸取無菌生理鹽水于6支試管中，每管9.9mL。用一支1mL無菌吸管吸取待分離菌液0.1mL，加入1號(hào)試管中，用吸管吹取3次，使之混合均勻。然后用無菌吸管從此試管中吸取0.1mL混合菌液(無菌操)，加入2

29、號(hào)試管中混合均勻，依此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6不同稀釋度的混合菌稀釋液。取滅菌的空平皿分別在底面用記號(hào)筆寫上10-4、10-5和10-63個(gè)稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管混合菌稀釋液中各吸取0.1mL，對號(hào)放入已寫好稀釋度的空平皿中，每一平皿內(nèi)傾入適量已融化且冷至4550左右的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，迅速將平皿輕輕前后左右搖動(dòng)，使稀釋液與融化瓊脂均勻混合。然后平放于桌上，靜置，待冷后倒置于37溫箱培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察結(jié)果。(4)斜面培養(yǎng)基接種法在斜面培養(yǎng)基試管上用記號(hào)筆標(biāo)明待接種的菌種名稱、日期和接種者。點(diǎn)燃酒精燈。將菌種試管

30、和待接種的斜面試管，用大拇指和食指、中指、無名指握在左手中，試管底部放在手掌內(nèi)并將中指夾在兩試管之間，使斜面向上成水平狀態(tài)，在火焰邊用右手松動(dòng)試管塞以利于接種時(shí)拔出。右手拿接種環(huán)通過火焰燒灼滅菌(參照平板分段劃線法)，在火焰邊用右手的手掌邊緣和小指，小指和無名指分別夾持棉塞(或試管帽)將其取出，并迅速燒灼管口。 將滅菌的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，先將環(huán)接觸試管內(nèi)壁或未長菌的培養(yǎng)基，使接種環(huán)的溫度下降達(dá)到冷卻的目的，然后再挑取少許菌苔。將接種環(huán)退出菌種試管，迅速伸入待接種的斜面試管，用環(huán)在斜面上自試管底部向上端輕輕地劃一直線，再從斜面底部向上輕輕曲折連續(xù)劃線。接種環(huán)退出斜面試管，再用火焰燒灼管口，并

31、在火焰邊將試管塞上。將接種環(huán)逐漸接近火焰再燒灼，如果接種環(huán)上沾的菌體較多時(shí)，應(yīng)先將環(huán)在火焰邊烤干，然后再燒灼，以免未燒死的菌種飛濺出，污染環(huán)境，接種病原菌時(shí)更要注意此點(diǎn)。將接種物于37溫箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察結(jié)果。注意事項(xiàng)取試管棉塞或管帽時(shí)要緩慢拔出，不宜用力過猛。所劃直線盡可能的直，切莫?jiǎng)潕讞l直線或蛇行，不要將培養(yǎng)基劃破，也不要使接種環(huán)接觸管壁或管口。 (5)液體培養(yǎng)基接種法在接種的試管上用記號(hào)筆標(biāo)明待接種的菌種名稱、日期和接種者。參照斜面培養(yǎng)基接種法握持菌種管及待接種的肉湯管。右手拿接種環(huán)通過火焰燒灼滅菌(參照平板分段劃線法)，在火焰邊用右手的手掌邊緣和小指，小指和無名指分別夾持棉塞(或

32、試管帽)將其取出，并迅速燒灼管口。接種環(huán)滅菌冷卻后，伸入接種管挑取少許菌苔退出菌種管，再伸入肉湯管，在液體表面處的管內(nèi)壁上輕輕磨擦，使菌體分散從環(huán)上脫開，進(jìn)入液體培養(yǎng)基中。接種完畢，重新滅菌接種環(huán)，塞好棉塞（或試管帽），放37溫箱培養(yǎng)。接種物若為液體培養(yǎng)物，則可用無菌吸管定量吸出后加入或直接倒入液體培養(yǎng)基。若向液體培養(yǎng)基中接種量大或要求定量接種時(shí)，可先將無菌水或液體培養(yǎng)基加入菌種試管，用接種環(huán)將菌苔刮下制成菌懸液(刮菌苔時(shí)要逐步從上向下將菌苔洗下，用手或振蕩器振勻)。將接種物于37溫箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果。注意事項(xiàng)取試管棉塞或管帽時(shí)要緩慢拔出，不宜用力過猛。塞好試管塞，完成接種后搖動(dòng)試管，使菌體在

33、培養(yǎng)液中分布均勻。整個(gè)接種過程都要無菌操作。(6)半固體穿刺接種法在接種的試管上用記號(hào)筆標(biāo)明待接種的菌種名稱、日期和接種者。參照斜面培養(yǎng)基接種法握持接種的半固體培養(yǎng)基。右手拿接種針通過火焰燒灼滅菌(參照平板分段劃線法)，在火焰邊用右手的手掌邊緣和小指，小指和無名指分別夾持棉塞(或試管帽)將其取出，并迅速燒灼管口。接種時(shí)先將接種針滅菌冷卻，挑取菌落，而后垂直穿入半固體培養(yǎng)基中心接近試管底部，但注意不可穿至管底，然后迅速沿原路退出。滅菌接種針，塞好棉塞（或試管帽），放37溫箱中，培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果。注意事項(xiàng) 接種針垂直穿入半固體培養(yǎng)基中心接近試管底部，但注意不可穿至管底，沿原路退出。4.細(xì)菌

34、培養(yǎng)方法(1)一般培養(yǎng)法 又稱需氧培養(yǎng)法，將已接種好標(biāo)本的各種培養(yǎng)基，置37溫箱中培養(yǎng)1824h，一般細(xì)菌即可于培養(yǎng)基上生長。但菌量很少或難于生長的細(xì)菌需培養(yǎng)37d甚至1個(gè)月。豬鏈球菌在羊血平板上的菌落形態(tài)霍亂弧菌在TCBS的平板上的菌落特征傷寒沙門菌在CHROM agar顯色培養(yǎng)基上的菌落特征梭菌在CCFA培養(yǎng)基上的生長特性布魯氏菌的菌落炭疽芽孢桿菌的菌落鼠疫耶氏菌菌落禽霍亂菌菌落 枯草芽胞桿菌菌落 鏈球菌的溶血環(huán)(2)二氧化碳培養(yǎng)法 是將某些細(xì)菌，如布魯桿菌，于CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。常用的產(chǎn)生CO2的方法有燭缸法和化學(xué)法。燭缸法：將已接種細(xì)菌的平板置于容量為2 000mL的干燥器內(nèi)(為了隔

35、絕空氣，缸蓋及缸口涂以凡士林)，放入小段點(diǎn)燃的蠟燭于缸內(nèi)，蓋密缸蓋。缸內(nèi)燃燭約于0.51min后因缺氧自行熄滅，此時(shí)容器內(nèi)二氧化碳含量約為510。將干燥器置于37溫箱中培養(yǎng)?；瘜W(xué)法(重碳酸鈉鹽酸法)：將已接種細(xì)菌的平板置于干燥器內(nèi)。取一容器（或平皿），按干燥器的容積分別加入重碳酸鈉0.4g/L與濃鹽酸0.35mL/L，兩者不接觸，將此容器(或平皿)放入干燥器內(nèi)。蓋緊缸蓋后傾斜容器，使鹽酸與重碳酸鈉接觸生成CO2。CO2培養(yǎng)箱法：按常規(guī)方法，采用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 (3)厭氧性細(xì)菌的培養(yǎng)法庖肉培養(yǎng)基法：將蓋在培養(yǎng)基液面的石蠟凡士林先于火焰上微微加熱，使其邊緣溶化，再用接種環(huán)將石蠟凡士林塊撥成斜立

36、或直立在液面上，然后用接種環(huán)或無菌滴管接種。接種后再將液面上的石蠟凡士林塊在火焰上加熱使其融化，然后將試管直立靜置，使石蠟凡士林凝固并密封培養(yǎng)基液面。破傷風(fēng)梭菌 產(chǎn)氣莢膜梭菌 正常對照 堿性焦性沒食子酸法大管套小管法：取1支已滅菌、帶橡皮塞的大試管，放入少許棉花和焦性沒食子酸。焦性沒食子酸的用量按它在過量堿液中能每克吸收100mL空氣中的氧來估計(jì)。取1支小試管瓊脂斜面，接種產(chǎn)氣莢膜梭菌、葡萄球菌。在大試管內(nèi)迅速滴入10的NaOH，使焦性沒食子酸濕潤，并立即將除掉棉塞已接種厭氧菌的小試管斜面(小試管口朝上)放入大試管中，塞上橡皮塞，如圖4-5，37培養(yǎng)，定期觀察斜面上菌種的生長狀況并記錄。培養(yǎng)皿

37、法：取玻璃板一塊或培養(yǎng)皿蓋，洗凈，干燥后滅菌。鋪上一薄層滅菌脫脂棉或紗布，將1g焦性沒食子酸放在其上。在培養(yǎng)基平板上一半劃線接種產(chǎn)氣莢膜梭菌，另一半劃線接種葡萄球菌，并在皿底用記號(hào)筆作好標(biāo)記。滴加10NaOH溶液約2mL于焦性沒食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養(yǎng)皿蓋上，必須將脫脂棉全部罩住，而焦性沒食子酸反應(yīng)物不能與培養(yǎng)基表面接觸，如圖4-6。以溶化的石蠟凡士林液密封皿底與玻板或皿蓋的接觸處，置37培養(yǎng)，定期觀察平板上菌種的生長狀況并記錄。 焦性沒食子酸培養(yǎng)基焦性沒食子酸培養(yǎng)基示意圖石蠟血平板紗布產(chǎn)氣莢膜梭菌血平板厭氧培養(yǎng) 結(jié)果觀察 厭氧生物袋法 用肉膏蛋白胨

38、瓊脂培養(yǎng)基倒制平板，凝固干燥后，平板劃線接種產(chǎn)氣莢膜梭菌和葡萄球菌，并作好標(biāo)記。接種好的平板放入袋中，排出袋中氣體，卷疊好袋口，用彈簧夾夾緊，然后折斷氣體發(fā)生小管中安瓿，使發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生CO2、H2等。在催化劑鈀的作用下，H2與袋中剩余O2生成H2O，使袋內(nèi)環(huán)境達(dá)到無氧。約30min后，再折斷美藍(lán)液安瓿(美藍(lán)在無氧環(huán)境中無色，在有氧環(huán)境中變成藍(lán)色)，如指示劑不變藍(lán)，表示袋內(nèi)已成無氧環(huán)境，此時(shí)即可放人37溫箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌種生長情況。厭氧培養(yǎng)箱法 它是將需厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)物置厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)箱是目前較為先進(jìn)的厭氧培養(yǎng)裝置,由手套操作箱及傳遞箱兩個(gè)主要部分組成，適用于在無氧環(huán)境中連

39、續(xù)進(jìn)行標(biāo)本接種、培養(yǎng)和鑒定等全部工作。手套操作箱是用塑料制成的，有兩個(gè)門，個(gè)與操作箱連結(jié)，一個(gè)可與外部相通，起緩沖作用，以保持操作箱內(nèi)的無氧環(huán)境不變。標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)器材通過此處進(jìn)出操作箱。由外向內(nèi)傳遞物品時(shí)，先將內(nèi)側(cè)門關(guān)嚴(yán)，物品進(jìn)入傳遞箱之后，關(guān)閉外側(cè)門。用真空泵排氣減壓，充入氮?dú)狻Ｖ貜?fù)排氣一次，氧可被排除99以上。通過手套用手打開側(cè)門，無氧混合氣體從操作箱自動(dòng)流入傳遞箱，恢復(fù)正常(詳見“常用儀器之厭氧培養(yǎng)箱”)。 5.注意事項(xiàng)（1）燭缸培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，缸內(nèi)點(diǎn)燃的蠟燭勿靠近缸壁，以免烤熱缸壁而炸裂。（2）配好的庖肉培養(yǎng)基試管若已放置了一段時(shí)間，則接種前應(yīng)將其置沸水浴中再加熱10min，以除去溶入的氧。而剛滅完菌的新鮮庖肉培養(yǎng)基可先接種后再用石蠟凡士林封閉液面，這樣可避免一些操作上的麻煩。在用火焰融化培養(yǎng)基液面上的石蠟凡士林時(shí)，應(yīng)注意不要使下面的培養(yǎng)基的溫度升得太高，以免燙死剛接入的菌種。（3）對于一般的厭氧菌，接種后的庖肉培養(yǎng)基可直接放在溫室里培養(yǎng)。而對于一些對厭氧環(huán)境要求比較苛刻的厭氧菌，接種后的庖肉培養(yǎng)基應(yīng)先放在厭氧罐中，然后再送溫室培養(yǎng)。（4）焦性沒食子酸遇堿性溶液后即會(huì)迅速發(fā)生反應(yīng)并開始吸氧，所以在采用此法進(jìn)行厭氧微生物培養(yǎng)時(shí)，必需注意只有在一切