細胞工程制藥技術

1、關于細胞工程制藥技術第一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 概述細胞工程動植物組織和細胞培養(yǎng)技術細胞融合技術細胞器移植技術和細胞重組技術體外受精技術染色體工程技術DNA重組技術第二張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 細胞融合技術第三張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）細胞融合（cell fusion)，又稱體細胞雜交（somatic hybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜 融合形成單個細胞的過程。一、細胞融合技術的建立和發(fā)展第四張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內(nèi)自

2、發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。1958年日本學者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細胞融合的效應。1974年華裔加拿大學者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生能

3、分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。20世紀80年代出現(xiàn)了電融合技術。（二）細胞融合研究進展第五張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間苷藍青菜大豆馬唐草矮牽牛龍面花大麥花生大麥大豆小麥矮牽牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麥蠶豆大豆草香木犀酵母菌雞大豆煙草大豆秋水仙人胡蘿卜番茄馬鈴薯人小鼠葉葉葉根愈傷組織葉葉花瓣種子種子葉懸浮細胞葉花瓣葉懸浮細胞葉懸浮細胞懸浮細胞懸浮細胞葉根懸浮細胞葉原生質(zhì)體血紅細胞懸浮細胞葉懸浮細胞葉腹水癌細胞原生質(zhì)體葉根尖纖維肉瘤細胞畸胎瘤細胞1972197219721972197219721972197219721972197219721

4、97219721972197219721972幾種細胞融合成功的例子第六張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月植物融合細胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細胞 第七張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月動物細胞融合實驗使用的小白鼠 第八張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞融合的意義理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這 對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和

5、增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。第九張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、動物細胞融合和體細胞雜交植物細胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖第十張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月顯微鏡下細胞融合過程第十一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月融合過程中兩個細胞膜從彼此接觸到破裂形成細胞橋的變化過程圖解第十二張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1、仙臺病毒法仙臺病毒誘導細胞融合經(jīng)四個階段：兩種細胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4條件下病毒附著在細胞 膜上。并使兩細胞相互凝聚；在37中，病毒與細胞膜發(fā)生

6、反應，細胞膜受到破環(huán)，此時需 要Ca2+和Mg2+，最適pH為8.0一8.2；細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；融合成巨大細胞，仍需ATP 。（一）促進細胞融合的方法第十三張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月病毒促使細胞融合的主要步驟如下：兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結作用下彼此靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體；進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。第十四張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖 第十五張，PPT共八十

7、一頁，創(chuàng)作于2022年6月 優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結構為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫熱的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細胞。PEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。2、聚乙二醇（PEG）法第十六張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程第十七張，PPT共八十一頁

8、，創(chuàng)作于2022年6月PEG的作用機理： Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。 PEG誘導融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。第十八張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月聚乙二醇（PEG）法細胞融合步驟（1）將兩種不同親本細胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1m

9、l 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng) 液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞。第十九張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3、電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：融合率高、重復性強、對細胞傷害??；裝置

10、精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。第二十一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電融合的基本過程：細胞膜的接觸：當原生質(zhì)體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。 第二十二張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電融合誘導法原理示意圖第二十三張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）雜交瘤技術第二十四張

11、，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十五張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月只針對某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。第二十七張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridoma cell)，雜交瘤細胞既能像骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridoma tec

12、hnology ）。第二十八張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 第二十九張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月雜交瘤技術的基本原理第三十張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月雜交瘤細胞的制備1、骨髓瘤細胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine

13、， T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十二張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2、免疫小鼠 免疫程序是取68周齡BalbC雌鼠，基礎免疫2周，靜脈再加強免疫一次，35天后用于融合。免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。抗原量同樣與抗原強弱有關，以IgG為例，第一次為100g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1l06一1107。第三十三張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3、脾細胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2

14、)無菌條件下取出脾臟，剃除結締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗， 令細胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng) 液，反復抽吸數(shù)次方法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可；(5)把細胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中 置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)分)計數(shù)、備用。第三十四張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月4、細胞準備（1）收集骨髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37)，計數(shù)活力細胞(不少

15、于90)；（2）收集小鼠脾細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37)，并計細胞數(shù)和測定活力細胞；（3）按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸 凈多余上清。第三十五張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月5、細胞融合(1)將1ml 40的PEG液一滴滴加入列細胞團中，在60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微 轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時細胞對機械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l

16、；(6)取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50 l ；(7)送入5CO2，溫箱中37培養(yǎng)，24小時后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。第三十六張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6、融合后細胞培養(yǎng)(1)融合后710天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的) 后每隔23天 半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)23周后出現(xiàn)雜交細胞集落，細胞個大、圓且透明；(4)待集落增殖生長至13孔時，應進行抗體檢測。第三十七張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶

17、脫氧核苷（thymidine， T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第三十八張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月7、抗體檢測免疫熒光試驗放射免疫試驗(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)第三十九張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月8、單克隆抗體的大量制備體內(nèi)法培養(yǎng)法第四十張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的應用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地用于臨床醫(yī)學的疾病 診斷，以提高疾病診斷的準確性。利用單克隆抗體技術可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成 本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能

18、用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛 在技術。單克隆抗體技術還可廣泛用于各種基礎醫(yī)學研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學的不 斷發(fā)展。 第四十一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月人源單克隆抗體主要困難（1）缺乏合適的人骨髓瘤細胞株作為融合親本?，F(xiàn)有的細胞株大多是融合率不高，雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，而且細胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（2）獲得抗原特異的人B淋巴細胞十分困難，因為對人來說，高度免疫獲得抗原特異的B淋巴細胞的方法顯然是不可行的；（3）大量繁殖雜交瘤細胞以獲得所需量的抗體，鼠類雜交瘤可通過小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水達到這一目的，但是人雜交瘤細胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。第四十

19、二張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體工業(yè)化生產(chǎn)及應用 單克隆抗體的生產(chǎn)包括細胞培養(yǎng)、提純和制劑等工藝。作為治療藥品應用的單克隆抗體則必須采用生物反應器，大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞。 單克隆抗體藥物：1986年，美國FDA批準了第一個單克隆抗體藥物上市，距今已經(jīng)整整20多年了。截止到現(xiàn)在，全世界共有21個治療用抗體藥物被批準上市，實現(xiàn)200億美元的銷售額，在國際，也在國內(nèi)形成了抗體藥物開發(fā)熱潮。 第四十四張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體工業(yè)化生產(chǎn)及應用 單抗藥主要用于癌癥和免疫性疾病的治療。現(xiàn)在有5大單抗藥物占據(jù)了

20、80%的市場份額，其中羅氏制藥Roche和基因泰克（NYSE:DNA）聯(lián)合開發(fā)上市的單抗藥物有3個，分別為Avastin、Herceptin和Rituxan；另外還有雅培公司（NYSE:ABT）的Humira和強生公司（NYSE:JNJ）的Remicade。5大單抗藥主宰市場的趨勢到2012年不會發(fā)生太大的變化，仍將占有70%的市場。至2012年，Biogen（Nasdaq:BIIB）、安進（Nasdaq:AMGN）和UCB（布魯塞爾證券交易市場：UCB.BR）也將有單抗藥物上市。 第四十五張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，

21、PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十八張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十九張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月三、植物原生質(zhì)體融合和體細胞雜交植物原生質(zhì)培養(yǎng)和細胞融合可用產(chǎn)生遠緣雜種；是目前植物細胞及基因工程的核心技術。第五十張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 通過一定方法除去細胞壁，而得到一個裸露的植物細胞，即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體像正常的植物細胞那樣具有全能性，在一定條件下培養(yǎng)可以重新再生出完整植株。第五十一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 自1970年首次獲得煙草原生質(zhì)體再生植株成功以來，通過原生質(zhì)

22、體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有20種為我國首先報道。 原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過程。第五十二張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月(一) 原生質(zhì)體的制備：1、材料來源與預處理：（1）材料來源： 可以用各種組織和器官，但多應用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。 第五十三張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）預處理： A.預質(zhì)壁分離：17-20 酶液中靜置半小時，再于2834保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達到質(zhì)壁分離目的； B. 預培養(yǎng): 將除去下表皮的葉片于誘導愈傷組織

23、培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高； C. 暗處理: 將室溫下生長57個星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力； D.光處理: 將葉片于日光或燈光下照射26h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離； E.低溫處理: 夏季應用的實驗材料其萌動種子應于4過夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。第五十四張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 制備原生質(zhì)體的酶類： 高等植物細胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細胞生長的不同階段及不同物種的細胞壁組成與結構不同，木質(zhì)化及次生加厚的細胞壁不被酶消化，故選擇材

24、料和消化細胞壁的酶類是制備原生質(zhì)體關鍵。第五十五張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月常用的酶類有：A. 纖維素酶，如Onozuka R10及RS，國內(nèi)常用的為EA3867，其中含少量果膠酶；B. 果膠酶，如Macerozyme R10 又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過2，作用時間長有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y23，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為01，懸浮細胞為005；C. 崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；D. 半纖維素酶，如Rhozyme HP150，用于懸浮細胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細胞原生

25、質(zhì)體的分離;E 蝸牛酶，主要用于體細胞原生質(zhì)體分離。第五十六張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶液配制： 需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl22H20(0. 1mmol/l一10mo1l)及KH2PO4 (0. 75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。 酶液pH值相當重要，纖維素酶及果膠酶單獨使用時，其pH分別以5.4及5.8為宜；混合使用時pH5.4-pH5.6為宜，降至48以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。第五十七張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 3原生質(zhì)體分離及純化（1）分離：

26、原生質(zhì)體分離有機械法及酶消化法，前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分一步法及二步法。 一步法是將材料在2l一28用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理224h。 二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。第五十八張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）純化 A. 沉降法: 原生質(zhì)體混合物經(jīng)微孔過濾后，低速（150g）離心5min, 沉淀再用與酶液具相同糖濃度溶液反復洗3-4次，后用培養(yǎng)液洗滌備用； B. 飄浮法: 離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細胞時可用20蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面碎片及老細胞沉降而得以純化，純度高，但產(chǎn)量低； C. 不連續(xù)梯度離

27、心法：將原生質(zhì)粗提液置于不連續(xù)濃度梯度的溶液中，經(jīng)離心后分離不同比重的原生質(zhì)體。第五十九張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 4原生質(zhì)體活力測定 純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測定后方可用于培養(yǎng)。（1）根據(jù)形態(tài)特征判斷其活力：原生質(zhì)體呈綠色（若來源于葉片）及圓而鼓者為活原生質(zhì)體。（2）熒光染料活體染色法：熒光素染料可自由透過細胞膜，在細胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過細胞膜而滯留于細胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強度即可判斷原生質(zhì)體死活。（3）酚藏花紅染色法：活原生質(zhì)體能吸收呈紅色，無活性的則不能吸收而無色。第六十張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)： 1. 培養(yǎng)方

28、法：（1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，1. 2%瓊脂。（2）液體培養(yǎng)： A. 淺層培養(yǎng)法: 其過程是將1mL原生質(zhì)體懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或25mL三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)初期振搖12次，防止粘壁； B. 固液結合培養(yǎng)法：在混好原生質(zhì)體的固體培養(yǎng)基表面加一層相同成分的液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。效果較好。第六十一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 培養(yǎng)條件： 密度： 平板培養(yǎng)103104個/ml, 液體培養(yǎng)104105個/ml溫度： 多數(shù)為25-28 oC, 少數(shù)1637 oC光照：500 lx,18h 或2800 lx 連續(xù)光照 多數(shù)要求黑暗或弱光第六十二張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于

29、2022年6月3. 細胞壁再生及細胞分裂： l-3天即再生新細胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓?？捎觅|(zhì)壁分離法證實。也可用0. 1% ST型或WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍色熒光。經(jīng)后者染色，有細胞壁者發(fā)射綠色熒光。 在原生質(zhì)培養(yǎng)過程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細胞核周圍常在1一2周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細胞分裂頻率不同。第六十三張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月4、愈傷組織或胚狀體形成 原生質(zhì)體再生的細胞一旦開始分裂，就可能繼續(xù)生長： A 形成細胞團，發(fā)育成愈傷組織； B. 形成胚狀體，再產(chǎn)生植株； C. 形

30、成愈傷組織，再形成胚狀體。 隨著細胞分裂及細胞團形成，已與常規(guī)細胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)34周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細胞的營養(yǎng)，亦利于細胞團及小愈傷組織的生長。第六十四張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 5. 植株再生 大多經(jīng)愈傷組織誘導分化再生為完整植株。當愈傷組織達到12mm時，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于： (1) 只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑； (2) 與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細胞分裂素濃度高于生長素; (3) 在誘導器官分化過程中，一般采用15001x左右的高光強。誘導器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。 第六十五張

31、，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 （三） 原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的： 1、利用原生質(zhì)體不具細胞壁的特性可以進行細胞器移植和外源物的攝取，原生質(zhì)體之間可以進行融合而產(chǎn)生雜種細胞(即體細胞雜交）。2、是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對植物原生質(zhì)體進行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。3、也是研究細胞生物學、分子生物學、體細胞無性系變異和植物病理學研究的有用工具。第六十六張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月A-E, 培養(yǎng)的歐當歸(Levisticum officinale Koch)原生質(zhì)體分裂再生成植株的過程 F-L, 培養(yǎng)過程的核變化；F.多核，G.核穿

32、壁，H.無絲分裂，I.染色體橋，J. 2n=22，K.L.多倍體. A-D當歸(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗 E-H,紅豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株 第六十七張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十八張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十九張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）原生質(zhì)體融合： 在外界因素作用下，兩個或兩個以上植物細胞合并成一個多核細胞的過程稱為植物細胞融合，或植物體細胞雜交。但由于植物細胞具有堅硬的細胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細胞壁釋放出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學特性與完整細胞基本相同。在適當條件下來源不同的植物原生質(zhì)體可產(chǎn)生融合作用，并可再生細胞壁，形成完整植株。第七十一張，PPT共八十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1、作用：(1) 可實現(xiàn)遠緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性；(2) 可獲得含另一