骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化與標(biāo)記

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化與標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟吳曉林,李冬民,馬德茂,張曉田,黃石,宋天保【關(guān)鍵詞】骨髓【Abstrat】AI:Tstudythedifferentiatinharateristisandtheptialdsageandtiingfrbrdexyuridine(Brdu)labelingfratbnearrderivedesenhyalsteells(Ss)invitr.ETHDS:TheratarrsteellsislatedbyusingPerll(1.073kg/L)ereulturedandprliferated.Thethirdpassageellsereinduedit

2、hdexaethase,glyerphsphate,asrbiaid2phsphate,IGF1andinsulin.nday21,theellsereanalyzedbyiunhistheistryfrtypellagenandbyhistheistryfralkalinephsphatase(AKP).ThepurifiedSsereinubatedithBrduatdifferentnentratins(5,10and15l/L)frdifferenttieperids(12，24，48，72and96h),flledbyiunhistheistryfrBrdutidentifythep

3、tialBrdunentratinandinubatintieperid.RESULTS:Afterinubatinfr21dfrindueddifferentiatinintsteblasts,typellagenandAKPerepsitivelyexpressed.Theinubatinith10l/LBrdufr72hahievedver98%fthelabelingrateithutprduingbviuselldaages.NLUSIN:Ssanbeinduedtdifferentiateintsteblastsunderertainnditinsinvitr.TheptialBr

4、dulabelingnentratinandtieperidare10l/Land72h,respetively.【Keyrds】Ss;indueddifferentiatin;steblast;Brdu【摘要】目的：探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Ss在體外的誘導(dǎo)分化及5溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟Ss的可行性.要領(lǐng)：使用密度為1.073kg/L的perll分散骨髓的單個(gè)核細(xì)胞，體外造就與擴(kuò)增Ss；取生長(zhǎng)精良的第3代細(xì)胞，用成骨細(xì)胞分化造就液造就21d，型膠原免疫組化染色和堿性磷酸酶AKP組化染色；別離以濃度為5，10和15l/L的Brdu溶液標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟Ss，孵育12，24，48，72和9

5、6h后免疫組化檢測(cè)Brdu，確定最正確標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟量和最正確標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟時(shí)間.結(jié)果：誘導(dǎo)分化第21日,AKP染色呈強(qiáng)陽(yáng)色,型膠原免疫染色呈陽(yáng)性.10l/LBrdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟Ss的結(jié)果最好，隨著孵育時(shí)間的延伸，Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟率漸漸增高，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟72h后標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟率在90%以上.結(jié)論：Ss在體外必然條件下可定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，用Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟Ss的最正確濃度為10l/L，最正確時(shí)間是72h.【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；成骨細(xì)胞；5溴脫氧尿嘧啶核苷0弁言骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(esenhyalsteells，Ss)是一類具有多向分化潛能的構(gòu)造干細(xì)胞.因Ss取材便利、對(duì)機(jī)體

6、的損傷孝具有較強(qiáng)的傳代增殖本領(lǐng)和免疫耐受性等特點(diǎn)而受到越來(lái)越多的存眷.本實(shí)行的目的是使用Ss具有分化潛能的特點(diǎn)，在體外誘導(dǎo)該細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞.并用Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟一連傳代的Ss，不雅察最正確標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟時(shí)間及標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟劑量，從而為追蹤Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的Ss移植入體內(nèi)后的存活、生長(zhǎng)及分化奠基底子.1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料康健雄性SD大鼠，體質(zhì)量5570g.由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)行動(dòng)物中央提供.1.2要領(lǐng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處置懲罰：Brdu免疫構(gòu)造化學(xué)染色后，隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野100計(jì)數(shù)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，盤算Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟率.數(shù)據(jù)以xs表現(xiàn)，接納SPSS10.0軟件舉行方差闡發(fā)及LS

7、Dt兩兩比力，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.2Ss向成骨細(xì)胞的分化在誘導(dǎo)分化的第7日，細(xì)胞由梭形開(kāi)始變?yōu)槎嘟切?第14日，部門細(xì)胞變寬大，且伸出多個(gè)絲狀突起；AKP染色呈黑褐色，型膠原免疫組化染色陽(yáng)性不顯著.第21日，AKP染色呈強(qiáng)陽(yáng)色,型膠原免疫組化染色呈陽(yáng)性圖2.正常比擬組和陰性比擬實(shí)行均未見(jiàn)顯著染色.3討論骨髓Ss具有自我更新和多向分化的潛能1，已經(jīng)成為緊張的構(gòu)造工程種子細(xì)胞2-3.由于Ss具有多種標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟，而如今尚未挑選到其獨(dú)占的標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟分圖310l/LBrdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟Ss12(A,400),48(B,100)和72h(,100)子，給Ss的斷定帶來(lái)必然困難4.如

8、今Ss的斷定常接納兩種要領(lǐng)：去除法：骨髓中不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞、血細(xì)胞抗原的細(xì)胞，而上述細(xì)胞別離有D34和/或D45的表達(dá)：逆推法：在造就歷程中，賜與得當(dāng)刺激因子，細(xì)胞出現(xiàn)分化表型，如向成骨、成脂標(biāo)的目的誘導(dǎo)分化等，從而逆推其為Ss5.我們接納后者，給細(xì)胞參加誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)樂(lè)成，從而證明得到的細(xì)胞即為Ss.細(xì)胞移植起首碰到的題目是怎樣標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟移植的細(xì)胞，進(jìn)而跟蹤其存活、生長(zhǎng)、分化的歷程.細(xì)胞增殖周期包羅G1，S，G2和期4個(gè)時(shí)期，S期是DNA合成期，細(xì)胞內(nèi)DNA舉行半保存復(fù)制.Brdu是一種嘧啶雷同物，其尿嘧啶的堿基嘧啶環(huán)中與5位原子毗連的甲基被溴

9、取代.當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期而同時(shí)又有Brdu存在時(shí)，就會(huì)有Brdu摻入新合成的DNA中，只要細(xì)胞不滅亡，這種Brdu在胞核的DNA中恒久存留.本實(shí)行我們接納Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟Ss后，細(xì)胞的形態(tài)、增殖均不受影響，故用Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟細(xì)胞較為寧?kù)o可靠.且傳代細(xì)胞可一連被標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟，提示移植細(xì)胞可在體內(nèi)一連追蹤不雅察，為進(jìn)一步追蹤活體內(nèi)的移植細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變革提供了理論引導(dǎo).與同位素和熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟技能比擬力，Brdu抗體不與胸腺嘧啶產(chǎn)生交織反響，沒(méi)有放射性，化學(xué)染色可直接不雅察其在細(xì)胞內(nèi)的摻入環(huán)境，檢測(cè)的特異性高、標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟率高，并且實(shí)行歷程敏捷、輕便、寧?kù)o，因此是反響細(xì)胞增殖及追蹤移植

10、細(xì)胞的抱負(fù)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟要領(lǐng)6.我們確定了Brdu標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟骨髓Ss的最正確濃度和時(shí)間是10l/L，72h.【參考文獻(xiàn)】1PittengerF,akayA,BekS,etal.ultilineageptentialfadulthuanesenhyalsteellsJ.Siene,1999,284(5411):143-147.2HakunD,FukudaK,akinS,etal.Bnearrderivedregeneratedadiyytes(Gells)expressfuntinaladrenergiandusarinireeptrsJ.irulatin,2002,105(3):380-386.3江遜,崔鵬程,陳文弦,等.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外造就及生物特性的不雅察J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2022，24(4):351-353.4TiA,FrteL.esenhyalsteell:UseandperspetivesJ.HeatlJ,2022,