大青葉有效單體抗呼吸道合胞病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、大青葉有效單體抗呼吸道合胞病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的討論中藥大青葉單體1#，2#，3#，4#體外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法通過(guò)觀察病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)ytpathgenieffet,PE和TTethylThiazlylTetrazliu，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法檢測(cè)藥物抗RSV活性,計(jì)算藥物對(duì)病變的抑制率和半數(shù)抑制濃度50%inhibitingnentratin,I50，并從藥物抗病毒吸附，藥物對(duì)病毒的直接殺滅作用及抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的生物合成3個(gè)方面初步探究大青葉單體抗RSV活性的作用機(jī)制。結(jié)果大青葉單體1#，2#，3#，4#對(duì)RSV無(wú)直接滅

2、活作用,也不能阻止RSV的吸附，而能抑制RSV在Hep-2細(xì)胞內(nèi)的的生物合成，其半數(shù)抑制濃度(I50)分別為32.57，26.37，31.60，29.61g/l,治療指數(shù)(TI)分別為6.15，10.50，9.21，13.22，其抗病毒效果優(yōu)于病毒唑(I50=103.20g/l,TI=5.21)和抗病毒口服液(I50=105.21g/l,TI=5.03)，P0.01。結(jié)論大青葉單體1#，2#，3#，4#能平安高效地抑制RSV在Hep-2細(xì)胞中的增殖，抑制作用發(fā)生在病毒入侵細(xì)胞后?！娟P(guān)鍵詞】大青葉單體呼吸道合胞病毒細(xì)胞病變效應(yīng)法TT法大青葉FliuIsatidis，簡(jiǎn)稱(chēng)FI為十字花科植物菘藍(lán)Is

3、atisindigtiaFrt的枯燥葉。味甘，氣寒，無(wú)毒，入肝、心、胃經(jīng)，清熱涼血，為解毒要藥。?名醫(yī)別錄?記載：“療時(shí)氣頭痛，大熱，口瘡。?本草綱目?記載：“主熱毒痢，黃疸，喉痹，丹毒。它既能清心胃實(shí)火，治溫?zé)岵⌒奈付臼?，發(fā)斑發(fā)疹，又善解毒利咽，涼血消腫，用治喉痹口瘡、咽喉腫痛。據(jù)報(bào)道，大青葉在臨床上多用于流行性感冒持續(xù)高熱、上呼吸道感染、流行性乙型腦炎、急性傳染性肝炎等病毒性疾玻而呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起，其中呼吸道合胞病毒RSV居首位1。鑒于此，我們從中藥大青葉中提取有效成分，制備成大青葉單體，實(shí)驗(yàn)選用微孔細(xì)胞培養(yǎng)和TT法，以Hep-2細(xì)胞作為體外挑選細(xì)胞模型，檢測(cè)其對(duì)R

4、SV的抑制作用，為挑選新型抗病毒藥物和大青葉的臨床應(yīng)用提供思路和理論根據(jù)。1材料中藥大青葉FliuIsatidis，簡(jiǎn)稱(chēng)FI單體1，2，3，4#褐色顆粒，溶于水，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院藥劑科方建國(guó)教授提供。病毒唑和抗病毒口服液由南京第三制藥廠消費(fèi)，批號(hào)080302。Hep-2(鼻咽癌)細(xì)胞為武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供，RSV由英國(guó)Glasg大學(xué)兒童衛(wèi)生系Patn博士贈(zèng)送。RPI-1640和TT為Hylne公司產(chǎn)品。二甲基亞砜DS由上海菲達(dá)提供。新生小牛血清購(gòu)自三利公司。2方法2.1病毒滴度測(cè)定將毒株作10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度重復(fù)10孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。于37下孵育2h，換細(xì)

5、胞維持液。每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)PE，約37d后PE不再增多時(shí)，按Reed-uenh方法計(jì)算TID50。2.2藥物對(duì)細(xì)胞的毒性的測(cè)定用乙酶將生長(zhǎng)良好的Hep-2細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按1105/l濃度分種于40孔板，每孔0.1l。置33，5%2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄培養(yǎng)液上清，換含不同濃度的含藥維持液，每孔200l。大青葉1，2，3，4#單體的濃度分別為10，20，40，80，160，320，640，800，1600g/l。每種濃度重復(fù)4孔，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照、陽(yáng)性藥物病毒唑和中藥抗病毒口服液對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，以TT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。并根據(jù)如下公式計(jì)算細(xì)胞

6、存活率，找出藥物對(duì)細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度范圍。細(xì)胞存活率%=藥物組平均D570/細(xì)胞對(duì)照組平均D570100%。2.3細(xì)胞活性測(cè)定(TT染色法)根據(jù)sann建立的四甲基偶氮唑鹽TT法測(cè)定細(xì)胞活性。棄培養(yǎng)上清液,每孔加5g/lTT的不含血清的RPI-164050l，37,5%2孵育46h,黃色的TT被活細(xì)胞的線粒體脫氫酶復(fù)原成藍(lán)色的甲簪結(jié)晶，小心吸出TT,PBS洗3次，每孔加50lDS終止反響,振蕩混勻,在15in后甲簪結(jié)晶被溶解,在波長(zhǎng)570n下測(cè)定吸光度D值。D值與活細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)。2.4藥物抗RSV活性機(jī)理的實(shí)驗(yàn)2.4.1藥物對(duì)RSV生物合成的抑制作用實(shí)驗(yàn)于已長(zhǎng)成單層的Hep-2細(xì)胞40孔

7、板上，每孔接種100l的100TID50的RSV病毒液，于33吸附90in，棄病毒上清。根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在大青葉無(wú)毒濃度范圍內(nèi)，參加2，4，8，16，32，64，128g/l的不同濃度的含藥維持液每孔0.2l，每日觀察PE,隔天換新穎含藥維持液。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照、陽(yáng)性藥物病毒唑和抗病毒口服液對(duì)照。約在病毒對(duì)照PE為“+PE記錄方法為：“-為無(wú)PE;“+為25%細(xì)胞出現(xiàn)PE;“+為50%細(xì)胞出現(xiàn)PE；“+為75%細(xì)胞出現(xiàn)PE;“+為100%細(xì)胞出現(xiàn)PE時(shí)棄培養(yǎng)液上清，用TT法檢測(cè)病毒抑制率,并根據(jù)如下公式計(jì)算藥物對(duì)RSV的病毒抑制率2。病毒抑制率%=藥物處理組D570-病

8、毒對(duì)照組D570細(xì)胞對(duì)照組D570-病毒對(duì)照組D570100%2.4.2藥物直接滅活病毒實(shí)驗(yàn)將50l的100TID50/l滴度的RSV和150l不同濃度的藥物作用4h，反響體系為0.2l。含并保證藥物的終濃度與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)一樣。然后將混合液接種于單層Hep-2細(xì)胞中,孵育1.5h后，換用2%E培養(yǎng)液維持細(xì)胞生長(zhǎng)，37，5%2培養(yǎng),逐日觀察PE。2.4.3藥物抗病毒吸附實(shí)驗(yàn)分別將不同濃度的藥物加到Hep-2單層細(xì)胞孔中,37吸附90in,棄上清,再加100TID50/l滴度的RSV100l/孔,37吸附90in后,棄上清,加細(xì)胞維持液,37，5%2培養(yǎng),逐日觀察PE。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3

9、.1病毒滴度按Reed-uenh法計(jì)算病毒的TID50為10-4，即接種滴度為10-4的病毒每孔0.1l，可使50%細(xì)胞發(fā)生明顯病變。實(shí)驗(yàn)用病毒濃度為100TID50。3.2藥物對(duì)細(xì)胞的毒性將大青葉單體1，2，3，4#和病毒唑及抗病毒口服液的不同濃度對(duì)細(xì)胞的毒性。結(jié)果見(jiàn)表1。表1大青葉單體1，2，3，4#對(duì)Hep-2細(xì)胞的毒性作用略通過(guò)光鏡觀察,大青葉單體1#，2#，3#，4#對(duì)Hep-2細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為：細(xì)胞粘連，變圓，壁厚，破碎，脫落，胞漿內(nèi)顆粒增加，折光性增強(qiáng)。并且吸光值明顯下降，吸光度D值在0.10以下。從表1可知，大青葉單體1#，2#，3#，4#與病毒唑和抗病毒口服液的T50200

10、g/l,說(shuō)明其平安系數(shù)大。藥物在160g/l范圍內(nèi)約有半數(shù)或以上的細(xì)胞存活，從而確該藥物濃度為對(duì)Hep-2細(xì)胞敏感病毒的抗病毒實(shí)驗(yàn)的最高允許濃度；但細(xì)胞經(jīng)較高濃度的藥物作用后，藥物毒性增強(qiáng)，死亡細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞存活率降低如圖1所示。經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與細(xì)胞存活率之間存在直線關(guān)系，P0.01。其直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為：Y1#=59.0060.042X，r1#=0.815；Y2#=63.9760.045X，r2#=0.827；Y3#=64.4660.045X，r3#=0.835；Y4#=69.4510.045X，r4#=0.849。4者相比擬，1#單體的毒性最大，經(jīng)t檢驗(yàn)，P0.01；2#

11、單體與3#單體對(duì)細(xì)胞的毒性作用一樣，經(jīng)t檢驗(yàn)，P0.05；4#單體毒性最小，經(jīng)t檢驗(yàn)，P0.01。但將4種單體的T50與陽(yáng)性藥物病毒唑及抗病毒口服液相比，經(jīng)t檢驗(yàn)，P0.01,有顯著性差異，說(shuō)明大青葉單體的毒性更大。3.3藥物抗病毒生物合成的作用RSV對(duì)Hep-2細(xì)胞PE表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓，壁厚，折光性減弱，多個(gè)細(xì)胞交融形成大泡，有合胞體形成4872h后，用TT法按公式計(jì)算大青葉單體1#，2#，3#，4#對(duì)RSV的抑制率，并根據(jù)治療指數(shù)TI=T50/I50，計(jì)算各種藥物的治療指數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。表2中藥大青葉單體1，2，3，4#的抗RSV細(xì)胞內(nèi)生物合成作用略由表2可知隨藥物濃度增加，其抗病毒活

12、性增強(qiáng)，病毒抑制率升高見(jiàn)圖2。經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與病毒抑制率間有直線關(guān)系，P0.01。其直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為：Y1#=31.044+0.530X，r1#=0.898；Y2#=34.135+0.538X，r2#=0.806；Y3#=29.490+0.572X，r3#=0.904；Y4#=33.495+0.506X，r4#=0.923。藥物濃度在在128g/l以上時(shí)，對(duì)RSV細(xì)胞病變抑制程度可達(dá)90%左右。4種單體的I50和TI相比擬，4#單體的I50值略小，TI值略大于其他3號(hào)單體。但通過(guò)t檢驗(yàn)，4種單體間抗RSV活性無(wú)顯著性差異，P0.05。將4種單體在2128g/l范圍內(nèi)的抗RSV

13、抑制率與陽(yáng)性對(duì)照藥物相比，經(jīng)t檢驗(yàn)，P0.01，有顯著性差異，大青葉單體的體外抗RSV優(yōu)于病毒唑和抗病毒口服液。3.4藥物直接滅活病毒的作用和藥物抗病毒吸附的作用按實(shí)驗(yàn)方法“2.4.2和“2.4.3項(xiàng)將藥物與病毒混合后再作用與細(xì)胞,或者將藥物與細(xì)胞作用后再感染病毒,逐日觀察細(xì)胞病變。通過(guò)光鏡觀察，發(fā)現(xiàn)各提取部位不同濃度組均出現(xiàn)典型RSV感染所致的PE，且與病毒對(duì)照孔無(wú)顯著區(qū)別。通過(guò)測(cè)定各孔D570并計(jì)算不同藥物濃度時(shí)的病毒抑制率，也沒(méi)有高于7%的抑制率和隨藥物濃度增加而病毒抑制率升高的趨勢(shì)，說(shuō)明各單體均不能直接殺滅RSV，也無(wú)阻斷其吸附作用。4討論呼吸道合胞病毒(Respiratrysynyt

14、ialvirus,RSV)是一種RNA病毒，屬于副粘病毒科(Parayxviridae)3。它是世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染,特別是病毒性肺炎(約50%)和毛細(xì)支氣管炎(約90%)的重要病原4。RSV每年易在冬春季引起爆發(fā)流行,持續(xù)約5個(gè)月，2歲內(nèi)兒童為高發(fā)感染人群；在成人特別是老年人和免疫抑制的人群也有爆發(fā)流行，而目前FDA批準(zhǔn)用于防治RSV感染的藥物，僅有病毒唑ribavirin，它應(yīng)用中常出現(xiàn)白細(xì)胞減少，劑量過(guò)大時(shí)可致頭痛、不可逆貧血、血清膽紅素升高等副作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有致畸的報(bào)道，在臨床尤其是嬰幼兒的應(yīng)用受到限制。而RSV疫苗也存在平安有效性待測(cè)和價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。我們選用清熱解毒中藥大青

15、葉，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大青葉單體對(duì)細(xì)胞毒性小，其無(wú)毒濃度在200g/l以上，對(duì)RSV所致的細(xì)胞病變具有較好的抑制作用，在2128g/l這一段濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)了較明顯的量效關(guān)系,說(shuō)明當(dāng)藥物缺乏以結(jié)合所有的病毒時(shí),剩余的病毒顆粒還會(huì)具有感染細(xì)胞并引發(fā)細(xì)胞病變的才能；當(dāng)藥物的量足夠時(shí),可以將絕大局部的病毒粒子結(jié)合從而防止細(xì)胞的感染。但當(dāng)藥物濃度大于128g/l時(shí)，其對(duì)細(xì)胞的毒性作用那么掩蓋了其抗病毒作用。但其單體成分對(duì)細(xì)胞的毒性比病毒唑要大，說(shuō)明還需要改良提取工藝，或修飾其構(gòu)造，使其毒性降低?？共《緦?shí)驗(yàn)中3種不同的加藥方式說(shuō)明，它對(duì)病毒無(wú)直接殺滅作用，可能是由于中藥成分溫和，不含有能破壞病毒的包膜的有效

16、成分或活性化合物；亦不能保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染，可能由于它不能針對(duì)細(xì)胞外表的單一病毒受體的成分,不能與細(xì)胞外表受體結(jié)合,從而不能預(yù)防病毒的感染。但是它對(duì)已經(jīng)進(jìn)入胞內(nèi)的呼吸道合胞病毒均有一定的抑制作用，能抑制病毒核酸復(fù)制或者阻止病毒蛋白合成，說(shuō)明其可能干擾或抑制了病毒基因組的釋放、復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。其詳細(xì)抗病毒機(jī)制值得從動(dòng)物體內(nèi)或者血清藥理學(xué)、分子生物學(xué)等進(jìn)一步深化研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1SukRanKi,hang-SekKi,NaYngLee.Rapiddetetinandidentifiatinf12respiratryvirusesusingadualpriinglignuletidesyste-basedultiplexPRassayJ.JurnalfVirlgialethds，2022,156(1-2):111.2ZalilaatiatRashid,EldieLahaye,DianeDefer.Islatinfasulphatedplysaharidefrareentlydisveredspngespeies(eltdryxgirardae)anddeterinatinfitsanti-herpetiativityJ.InternatinalJurnalfBilgialarleules.2022,44(3):286.3N.D.Day,