生物化學(xué)儀器分析-紫外

1、第3章 紫外光譜Ultraviolet Spectrometry, UV主講：孫立權(quán)2022/8/3112022/8/3123.1 紫外吸收光譜分析基本原理Principles of UV3.1.1紫外吸收光譜的產(chǎn)生3.1.2有機物紫外吸收光譜3.1.3有機物紫外吸收光譜3.1.4蛋白紫外吸收光譜3.1.5核酸紫外吸收光譜3.1.6紫外吸收光譜影響因素3.1.7 顯色反應(yīng)2022/8/3133.1 紫外吸收光譜分析基本原理Principles of UV3.1.1 紫外吸收光譜的產(chǎn)生Formation of UV1.概述基于物質(zhì)對紫外光選擇性吸收的分析方法。 250 300 350 400nm

2、1234e2022/8/3142.物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線M + 熱M + 熒光或磷光E = E2 - E1 = h量子化 ；選擇性吸收定性依據(jù)。M + h M *基態(tài) 激發(fā)態(tài)E1 （E） E22022/8/315可見紫外波長范圍：100-800 nm.(1) 遠(yuǎn)紫外光區(qū): 100-200nm (2) 近紫外光區(qū): 200-400nm(3)可見光區(qū):400-800nm3.1.1 紫外吸收光譜的產(chǎn)生Formation of UV2022/8/316可見光譜與紫外光譜的共同之處光譜法：可用于結(jié)構(gòu)鑒定、定性和定量分析；定性依據(jù)：特征吸收；定量依據(jù)：朗伯比耳定律；能級躍遷：分子中價電子能級躍遷；

3、光譜形狀：電子躍遷的同時，伴隨著振動、轉(zhuǎn)動能級的躍遷帶狀光譜。3.1.1 紫外吸收光譜的產(chǎn)生Formation of UV2022/8/317可見光譜與紫外光譜的共同之處吸收曲線（A-曲線）吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。關(guān)于吸收曲線的討論與可見光譜相同3.1.1 紫外吸收光譜的產(chǎn)生Formation of UV2022/8/3183.電子躍遷與分子吸收光譜物質(zhì)分子內(nèi)部三種運動形式：（1）電子相對于原子核的運動；（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動；（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動。3.1.1 紫外吸收光譜的產(chǎn)生Formation of UV2022/8/319分子具有三種不同能級

4、：電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應(yīng)的能量。分子的內(nèi)能：電子能量Ee 、振動能量Ev 、轉(zhuǎn)動能量Er即e+v+revr 3.電子躍遷與分子吸收光譜2022/8/3110能級躍遷電子能級間躍遷的同時，總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。3.電子躍遷與分子吸收光譜2022/8/3111討 論轉(zhuǎn)動能級間的能量差r：0.0050.050eV，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠(yuǎn)紅外區(qū)。遠(yuǎn)紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜；振動能級的能量差v約為：0.05eV，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；電子能級的能量差e

5、較大120eV。電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在紫外可見光區(qū)，紫外可見光譜或分子的電子光譜。 2022/8/3112討 論吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內(nèi)部能級分布狀況，是物質(zhì)定性的依據(jù)。吸收譜帶的強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關(guān)，也提供分子結(jié)構(gòu)的信息。通常將在最大吸收波長處測得的摩爾吸光系數(shù)max也作為定性的依據(jù)。不同物質(zhì)的max有時可能相同，但max不一定相同；吸收譜帶強度與該物質(zhì)分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。2022/8/31131有機化合物電子類型及電子躍遷類型三種價電子：電子、電子、n/p電子；電子躍遷類型：n； n； 。sp *s *RKE

6、,BnpECOHnpsH3.1.2 有機物紫外吸收光譜Ultraviolet spectrometry of organic compounds2022/8/3114分子軌道理論：成鍵軌道反鍵軌道。當(dāng)外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷，所需能量大小順序為：n n 3.1.2 有機物紫外吸收光譜Ultraviolet spectrometry of organic compounds2022/8/31152躍遷所需能量最大；電子只有吸收遠(yuǎn)紫外光的能量才能發(fā)生躍遷；飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外區(qū)；吸收波長200 nm；例：甲烷的max為125nm

7、, 乙烷max為135nm。只能被真空紫外分光光度計檢測到；作為溶劑使用。2022/8/31163n 躍遷所需能量較大。吸收波長為150250nm，大部分在遠(yuǎn)紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察到。末端吸收。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n躍遷。2022/8/31174 躍遷所需能量較小，吸收波長處于遠(yuǎn)紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)，max一般在104Lmol1cm1以上，屬于強吸收。 （1） 不飽和烴*躍遷乙烯*躍遷的max為165nm,max為: 1104 Lmol-1cm-1。 K帶共軛非封閉體系的*躍遷 C=C 發(fā)色基團， 但 *200nm。max=165nm 助色基團

8、取代 * (K帶)發(fā)生紅移2022/8/3118165nm 217nm (HOMO LVMO) max （2）共軛烯烴中的 *5 n躍遷含雜原子的雙鍵化合物，或者當(dāng)有雜原子上的孤對電子與碳原子上的*軌道，則可產(chǎn)生n *躍遷吸收。200400nm。禁阻躍遷，吸收強度很弱，200nm的光)，但當(dāng)它們與生色團相連時，就會發(fā)生n共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。 (auxochrome)2022/8/31237. 紅移與藍(lán)移紅移:max向長波方向移動。藍(lán)移 (或紫移):max向短波方向移動。增色效應(yīng)或減色效應(yīng):吸收強度即摩爾吸光系數(shù)增大或減

9、小的現(xiàn)象分別稱為。有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLmax和吸收強度發(fā)生變化。2022/8/31249. 有機化合物的吸收帶吸收帶(absorption band): 在紫外光譜中，吸收峰在光譜中的波帶位置。根據(jù)電子及分子軌道的種類，可將吸收帶分為四種類型。 R吸收帶 K吸收帶 B吸收帶 E吸收帶吸收帶及吸收帶類型吸收峰對應(yīng)的波長位置稱為吸收帶。R吸收帶：由于發(fā)生n躍遷而產(chǎn)生的吸收帶。n為禁阻躍遷，躍遷幾率很?。灰话愕?，R吸收帶的270nm，100；當(dāng)使用極性溶劑時， R吸收帶發(fā)生藍(lán)移。2022/8/3126吸收帶及吸收帶類型K吸收帶：由*躍遷而產(chǎn)生的吸收帶。發(fā)生在共

10、軛烯炔分子；吸收很強，104；波長位置小于R 吸收帶。1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 非極性 極性n *躍遷：蘭移； ； *躍遷：紅移； ；2022/8/3127吸收帶及吸收帶類型B吸收帶：位于278nm的吸收帶。由苯環(huán)的*躍遷引起；吸收較強， =1100 ；在非極性溶劑中測定時有精細(xì)結(jié)構(gòu)，而在極性溶劑中精細(xì)結(jié)構(gòu)消失。當(dāng)芳環(huán)與發(fā)色團直接相連時會同時出現(xiàn)K、B 兩帶(B 帶波長較長)，且B 帶產(chǎn)生紅移。若分子中含有n 電子，還會有R 帶同時出現(xiàn)。2022/8/3128吸收帶及吸收帶類型E吸收帶：在一定意義上，苯環(huán)可看成三個共軛的乙烯組成。苯環(huán)中的這種乙烯鍵和共軛乙烯鍵引起的紫外吸收帶分別

11、稱為E1 和E2 帶。四種吸收帶按能量高低排列：一般有E1E2KBR2022/8/312910. 吸收波長的計算非共軛體系：飽和烷烴；有助色團取代的衍生物；孤立發(fā)色團。共軛體系：共軛烯烴。2022/8/3130165nm 217nm (HOMO LVMO) max 基-是由非環(huán)或六環(huán)共軛二烯母體決定的基準(zhǔn)值；無環(huán)、非稠環(huán)二烯母體： max=217 nm共軛烯烴（不多于四個雙鍵） *躍遷吸收峰位置可由伍德沃德菲澤 規(guī)則估算。 max= 基+nii a.共軛烯烴中的 *異環(huán)（稠環(huán)）二烯母體： max=217 nm同環(huán)（非稠環(huán)或稠環(huán)）二烯母體： max=253 nmniI : 由雙鍵上取代基種類和個

12、數(shù)決定的校正項 (1)每增加一個共軛雙鍵 +30 (2)環(huán)外雙鍵 +5 (3)雙鍵上取代基：?；?OCOR） 0 鹵素（-Cl，-Br） +5烷基（-R） +5 烷氧基（-OR） +6 2172272022/8/31332022/8/3134b.羰基化合物共軛烯烴中的 * Y=H,R n * 180-190nm * 150-160nm n * 275-295nmY= -NH2,-OH,-OR 等助色基團K 帶紅移，R 帶蘭移；R帶max =205nm ；10-100K K R R n n 165nm n 不飽和醛酮K帶紅移：165250nmR 帶紅移：290310nm 2022/8/3135

13、c. , -不飽和羧酸及其酯 *躍遷K 帶紅移程度小于 ,-不飽和酮, max約200240nm，104。 由于存在這種共軛，羰基的親電子性降低，即接受C=C上電子，形成 *躍遷的能力降低，使 ,-不飽和酸及酯發(fā)生 *躍遷需要較大的能量， max藍(lán)移。2022/8/3136d. 芳香烴及其雜環(huán)化合物 苯：E1帶180184nm； =47000E2帶200204 nm =7000 苯環(huán)上三個共軛雙鍵的 *躍遷特征吸收帶；B帶230-270 nm =200 *與苯環(huán)振動引起；含取代基時， B帶簡化，紅移。max（nm） max苯254200甲苯261300間二甲苯2633001，3，5-三甲苯26

14、6305六甲苯2723002022/8/3137乙酰苯紫外光譜圖羰基雙鍵與苯環(huán)共軛：K帶強；苯的E2帶與K帶合并，紅移；取代基使B帶簡化；氧上的孤對電子：R帶，躍遷禁阻，弱；CCH3On * ; R帶 * ; K帶2022/8/3138苯環(huán)上助色基團對吸收帶的影響2022/8/3139苯環(huán)上發(fā)色基團對吸收帶的影響2022/8/3140. 立體結(jié)構(gòu)和互變結(jié)構(gòu)的影響順反異構(gòu)：順式：max=280nm； max=10500反式：max=295.5 nm；max=29000互變異構(gòu)： 酮 式：max=204 nm 烯醇式：max=243 nm 立體結(jié)構(gòu)和互變結(jié)構(gòu)的影響2022/8/3142. 溶劑的影

15、響1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 非極性 極性n *躍遷：蘭移； ； *躍遷：紅移； ；極性溶劑使精細(xì)結(jié)構(gòu)消失. 溶劑的影響非極性 極性 n n p npn *躍遷：蘭移； ； *躍遷：紅移； ；max(正己烷)max(氯仿)max(甲醇)max(水)230238237243n3293153093053.1.3 無機化合物紫外可見吸收光譜1. 電荷遷移躍遷 (1)配合物的電荷遷移躍遷 配合物分子吸收光輻射后，分子中的電子由配體的軌道躍遷到與中心離子相關(guān)的軌道上，或按相反方向轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電荷遷移躍遷吸收光譜。這種電荷遷移光譜通常發(fā)生在具有d電子的過渡金屬離子和有丌鍵的共軛體系的有機配位化合

16、物及許多水合無機離子中。這種配合物電荷遷移躍遷可表達(dá)為： 無機配位化合物紫外-可見吸收光譜的電子躍遷形式主要有電荷遷移躍遷和配位場躍遷 兩種形式。Mn+Lb-M(n-1) +L(b-1) -h2022/8/3145(2)過渡金屬離子與生色團試劑生成配合物的電荷遷移躍遷如Fe()與CNS離子配位。Fe3+CNS-2+hFe2+CNS2+電子給予體電子接受體分子內(nèi)氧化還原反應(yīng)； 104Fe2+與鄰菲羅啉配合物的紫外吸收光譜屬于此。2022/8/31 電荷遷移吸收光譜的波長取決于電子給予體和電子接受體相應(yīng)軌道的能量差。如金屬離子的氧化性強，而配位體L的還原性強，則發(fā)生電荷遷移所需的能量較小，則吸收光

17、波長會發(fā)生紅移 電荷遷移躍遷吸收光譜的譜帶較寬，并易受環(huán)境因素的影響，用其波譜定性及結(jié)構(gòu)分析比較困難。但電荷遷移吸收光譜最大的特點是摩爾吸收系數(shù)很大，一般在104107。因此，用這類吸收譜帶進行定量分析時，可以顯著提高檢測的靈敏度。相反，則吸收光波長會發(fā)生紫移。 2. 配位場躍遷（1）配體微擾的金屬離子d-d電子躍遷和 f - f 電子躍遷 在配體的作用下過渡金屬離子的d軌道和鑭系、錒系的f軌道裂分，吸收輻射后，產(chǎn)生d一d、 f 一f 躍遷； 必須在配體的配位場作用下才可能產(chǎn)生也稱配位場躍遷； （2）金屬離子微擾的配位體內(nèi)電子躍遷 金屬離子的微擾，將引起配位體吸收波長和強度的變化。變化與成鍵性

18、質(zhì)有關(guān)，若共價鍵和配位鍵結(jié)合，則變化非常明顯。 摩爾吸收系數(shù)很小，對定量分析意義不大，但可用于研究配合物的結(jié)構(gòu)，為現(xiàn)代無機配合物鍵合理論的建立、金屬酶和生物無機化學(xué)等提供非常有用的信息。2022/8/313.1.4 蛋白質(zhì)紫外吸收光譜蛋白質(zhì)具有很強的紫外吸收，通常情況下一般蛋白質(zhì)在紫外區(qū)的最大峰在280nm左右(見圖28)。2022/8/31493.1.4 蛋白質(zhì)紫外吸收光譜利用蛋白質(zhì)的這一特性，能夠設(shè)計多種蛋白質(zhì)定量分析的方法。同時，蛋白質(zhì)的最大吸收峰不同于核酸的260nm最大吸收峰。基于這種差異，仍然能夠利用紫外吸收對含有DNA的蛋白質(zhì)樣品進行定量分析。在小于240nm波長的紫外區(qū)有很強的

19、光吸收效應(yīng)，但較難利用這一特性。這是因為，在這一紫外區(qū)，很多緩沖液具有很強的紫外吸收，并且緩沖液一般濃度很高，這會嚴(yán)重干擾蛋白質(zhì)的定量分析。但如果背景緩沖液不具有紫外吸收的特性，則可以充分利用蛋白質(zhì)在200220nm的強紫外吸收性質(zhì)。2022/8/31503.1.4 蛋白質(zhì)紫外吸收光譜蛋白質(zhì)的紫外吸收特性主要是由蛋白質(zhì)所含的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等引起。由于苯環(huán)(包括共軛雙鍵等)的存在，這幾種氨基酸在240300nm的紫外區(qū)內(nèi)均具有強力的光吸收特性；雖然其他氨基酸也具有紫外吸收的性質(zhì)，但在此紫外區(qū)內(nèi)一般很弱，對蛋白質(zhì)的紫外吸收貢獻不大。2022/8/31513.1.4 蛋白質(zhì)紫外吸收光譜蛋白

20、質(zhì)的紫外吸收受多種因素的影響。由于蛋白質(zhì)分子為高分子聚合物，其構(gòu)象受多種 因素(如溶液的pH、離子強度、金屬離子、溫度和變性劑等)的影響；而蛋白質(zhì)構(gòu)象的變 化會改變具有紫外吸收的氨基酸在蛋白質(zhì)表面的分布，進而影響蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜。特別值得注意的是，如蛋白質(zhì)富含紫外吸收的氨基酸，其吸收系數(shù)會增加；相反，則降低。這 在蛋白質(zhì)的定量分析時需要注意。2022/8/31523.1.5 核酸紫外吸收光譜核苷、核苷酸、核酸的成分都有嘌呤和嘧啶堿基，這些堿基全含有共軛雙鍵，使得這些堿基能強烈吸收240290nm波段的紫外線，最大吸收在260nm左右。因此核酸、核苷酸和核苷具有紫外吸收特性，DNA鈉鹽在23

21、0nm處為吸收低谷，但它的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光度(absorbance)以A260表示，A260是核酸的重要性質(zhì)，在核酸的研究中很有用處。RNA鈉鹽的吸收曲線與DNA的無明顯區(qū)別。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以用紫外分光光度計加以定量及定性測定。2022/8/31533.1.5 核酸紫外吸收光譜雙鏈DNA和單鏈DNA的紫外光譜相似，摩爾吸收系數(shù)有大差。原因：雙鏈中堿基被包裹在雙鏈內(nèi)部，弱；單鏈外露，強。2022/8/3154 溫度對DNA的紫外吸收有明顯的影響。在溫度為70C以下，DNA以雙鏈形式存在，因此紫外吸收相對較低。在7085C時，溫度對DNA的紫外吸收具有顯

22、著的影響。85C以后，溫度的增加對DNA紫外吸收的影響很弱，這是由于在85C以上，DNA以單鏈形式存在，紫外吸收接近最大值。變性溫度(melting temperature，Tm)是指雙鏈DNA分離成兩個單鏈DNA時對應(yīng)的溫度。這一特性對DNA的分離分析非常重要。如PCR的設(shè)計就是基于DNA的變性溫度的基礎(chǔ)。3.1.6 影響UVVis分析的因素：【1】溫度 【3】溶液的濃度【2】pH的影響【4】光源狹縫的寬度【5】背景的吸收 1】條件 化學(xué)反應(yīng)，也就是顯色反應(yīng)對多種物質(zhì)進行測定，常利用顯色反應(yīng)將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質(zhì)。常見的顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等。3.1.7 顯色

23、反應(yīng)（條件和影響因素）這些顯色反應(yīng)，必須滿足以下條件： 【4】.反應(yīng)生成物的組成恒定?！?】. 反應(yīng)生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性，以保證測量過程中溶液的吸光度不變；【2】反應(yīng)有較高的選擇性，即被測組分生成的化合物吸收曲線應(yīng)與共存物質(zhì)的吸收光譜有明顯的差別；【1】反應(yīng)的生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強的吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；影響顯色反應(yīng)的因素：【1】酸度 顯色反應(yīng)最適宜的酸度范圍可通過實驗來確定：測定某一固定濃度的試樣的吸光度隨酸度的變化，以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液的PH值為橫坐標(biāo)作圖。【3】.顯色時間和溫度【2】.顯色劑的用量 測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調(diào)節(jié)透光度（吸光度為0）為10

24、0%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差。（3）、參比溶液的選擇參比溶液的選擇視分析體系而定，具體有： 1】溶劑參比 試樣簡單、共存其它成分對測定波長吸收弱，只考慮消除溶劑與吸收池等因素； 2】試樣參比 如果試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時，可按與顯色反應(yīng)相同的條件處理試樣，只是不加入顯色劑。3】試劑參比 如果顯色劑或其它試劑在測定波長有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。 4】. 平行操作參比 用不含被測組分的試樣，在相同的條件下與被測試樣同時進行處理，由此得到平行操作參比溶液。3.2 紫外分光光度計Ult

25、raviolet spectrometer一、基本組成general process二、分光光度計的類型types of spectrometer2022/8/3163一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1. 光源 在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。 可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在3202500 nm。 紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185400 nm的連續(xù)光譜。2022/8/31642、單色器將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出任一波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。棱鏡材料石英2022/8/31653、樣品室樣品室放置各種類型的吸收池

26、（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。2022/8/31664、檢測器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號常用的有光電池、光電管或光電倍增管。2022/8/31675、結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理。2022/8/3168二、紫外分光光度計的類型1.單光束：簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束：自動記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價格較高

27、。2022/8/3169二、分光光度計的類型3.雙波長：將不同波長的兩束單色光(1、2) 快速交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。=12nm。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。2022/8/3170光路圖2022/8/31713.3 紫外吸收光譜的應(yīng)用Applications of UV一、定性和定量分析qualitative and quantitative analysis二、有機物結(jié)構(gòu)確定structure determination of organic compounds2022/8/3172一、定性、定量分析1. 定性分析 max：化合物特性參數(shù)，可作為定性依

28、據(jù)； 有機化合物紫外吸收光譜：反映結(jié)構(gòu)中生色團和助色團的特性，不完全反映分子特性； 計算吸收峰波長，確定共軛體系等 甲苯與乙苯：譜圖基本相同； 結(jié)構(gòu)確定的輔助工具； max ， max都相同，可能是一個化合物； 標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫：46000種化合物紫外光譜的標(biāo)準(zhǔn)譜圖 The sadtler standard spectra ,Ultraviolet 2022/8/317331 八月 2022742. 純度鑒定依據(jù)： max ； 峰形狀和數(shù)量；A。生物大分子紫外吸收特征。核酸分子中含有堿基， max = 260nm核酸典型吸收：260nm；純核酸A280/ A260=0.5。蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基

29、酸， max = 280nm蛋白質(zhì)典型吸收：280nm；純蛋白A280/ A260 1.8。3. 定量分析依據(jù)：朗伯-比耳定律吸光度： A= b c；透光度：-lgT = b c。靈敏度高：max：104105 L mol-1 cm -1；測量誤差與吸光度讀數(shù)有關(guān)： A=0.434，讀數(shù)相對誤差最?。?022/8/3175代入朗伯-比爾定律有： c/c=0.4343T/TlgT要使測定的相對誤差c/c最小，求導(dǎo)取極小得出： lgT=-0.4343=A即當(dāng)A=0.4343時，吸光度測量誤差最小。 最適宜的測量范圍為0.20.8之間。測定方法【1】 單組分定量方法 單組分是指樣品溶液中含有一種組分

30、，或者是在混合物溶液中待測組分的吸收峰與其他共有物質(zhì)的吸收峰無重疊。其定量方法包括校準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)對比法和吸收系數(shù)法。1 校準(zhǔn)曲線法方法：配制一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選用適宜的參比，在相同的條件下，測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，作A-c曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可用最小二乘數(shù)處理，得線性回歸方程。 在相同條件下測定未知試樣的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以找到與之對應(yīng)的未知試樣的濃度。【2】 標(biāo)準(zhǔn)對比法 即將待測溶液與某一標(biāo)樣溶液，在相同的條件下，測定各自的吸光度，建立朗伯-比爾定律，解方程求出未知樣濃度與含量。 As=Kcs Ax=Kcx【3】 F因子法 二、有機化合物結(jié)構(gòu)輔助解析1. 由紫外譜圖可獲得的

31、結(jié)構(gòu)信息（1）200-400nm 無吸收峰。飽和化合物，單烯，非共軛烯。（2） 270-350 nm有吸收峰（=10-100）醛酮 n* 躍遷產(chǎn)生的R 帶。（3） 250-300 nm 有中等強度的吸收峰（=200-2000），芳環(huán)的特征 吸收（具有精細(xì)解構(gòu)的B帶）。（4） 200-250 nm有強吸收峰（104），表明含有一個共軛體系（K）帶。共軛二烯：K帶（230 nm）；不飽和醛酮：K帶230 nm ，R帶310-330 nm260nm,300 nm,330 nm有強吸收峰，3,4,5個雙鍵的共軛體系。 2022/8/31802.光譜解析注意事項(1) 確認(rèn)max，并算出，初步估計屬于何種吸收帶；(2) 觀察主要吸收帶的范圍，判斷屬于何種共軛體系；(3) 乙?；灰艬帶： 262 nm(302) 274 nm(2040) 261 nm(300)(4) pH值的影響 加NaOH紅移酚類化合物，烯醇。 加HCl蘭移苯胺類化合物。2022/8/31813. 分子不飽和度的計算定義：不飽和度是指分子結(jié)構(gòu)中達(dá)到飽和所缺一價元素的“對”數(shù)。如：乙烯變成飽和烷烴需兩個氫原子，不飽和度為1。計算： 若分子中僅含一，二，