鋅指蛋白在各個組織中表達量的測定

1、印記基因的鑒定及功能分析-鋅指蛋白在各個組織中表達量的測定生物技術孫業(yè)潤（1092810108）實驗目的：走進實驗室了解基本實驗儀器，練習對各種儀器的使用；學習PCR原理，掌握PCR操作；通過電泳對DNA進行分析；探究鋅指蛋白在不同組織中的表達量對比。實驗原理：1,聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火（復性）-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94C左右一定時間后，使模板DN

2、A雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至4060C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在DNA聚合酶的作用下，于72C左右，以dNTP為反應原料，靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。2，NDA凝膠電泳：NDA凝膠電

3、泳是常用的用于分離鑒定DNA,RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂糖作為支持物，利用DBA分子在涌動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電勢點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的移動速度與其相對分子質量成反比，當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色，在紫外燈光下可以檢測出DNA條帶，從而確定DNA片段在凝膠中的位置。與通過marker比較可進行更加深入的研究3，通過比較不同組織cDNA中鋅指蛋白基因PCR后DNA帶的亮度來確定表達量的多少，但是

4、DNA多也可能是因為模板中可能存在重復的編碼序列即基因的初始濃度高，所以要通過內參基因（在不同組織中表達穩(wěn)定的基因）來確定待測基因的初始濃度。4,鋅指基序（zincfingermotif）。許多轉錄因子中都含有鋅指基序。這些蛋白通常含有多個指狀結構可以插入靶DNA序列的大溝中。許多鋅指蛋白的比較表明，基序為多種氨基酸序列提供了各種識別DNA序列結構的框架。實驗材料及儀器:DNA凝膠電泳：材料：瓊脂糖，電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），儀器：微波爐，電泳槽PCR:材料：dNTP，腦舌心肝肺胎盤的cDNA鋅指蛋白引物，內參基因引物，酶，水，鎂離子儀器：PCR儀，PCR管其他儀器：微量移液器，簡要離心機

5、，漩渦混合儀等些實驗儀器的使用方法:1微量移液器，可以準確吸取少量的液體。一個完整的移液過程包括：1）容量設定2）安裝移液頭3）吸液先將移液器排放按鈕按至第一停點，再將吸液頭垂直浸入液面。盡量避免吸液頭浸入液面過深，以免液壓對吸液的精確度造成影響。同時可以避免在吸取粘稠液體時在吸液頭表面粘上液體影響吸取精度。松開移液器排放按鈕要平穩(wěn)，切記不能過快，以免導致液體吸入移液器內部。4）排液排液時，吸液頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一停點，略作停頓以后,再按至第二停點，這樣做可以確保吸液頭內無殘留液體。5）卸去移液頭一般用力下按吸液頭推出器即可卸掉吸液頭。6）如不使用，將移液器調到最大量程。2簡要離

6、心機，經(jīng)過簡要離心，粘在容器壁上的液體會被離心到底部，方便吸取3漩渦混合儀，混合，混勻液體。微量移液器（也稱槍）實驗步驟：1配置lOmlPCR體系按如下反應體系逐步加入各反應試劑:ComponentsVolumeFinalConcentrationddH2Otofinalvolume10ylNotapplicable10 xEasyTaqBuffer(含Mg2+)1yl1x25mMdNTPs0.8yl0.2mMForward+ReversePrimer(5yMeach)1yl0.2eachEasyTaqDNAPolymerase0.05yl2.5units1*cDNATemplate1ylas

7、required2使用PCR儀進行擴增按以下程序設定PCR反應程序：94C2-5min94C30sec50-60C30sec25-35cycles72Clmin/1-2kb72C5-10min16Cs3配置瓊脂糖凝膠1）用自來水或蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，將制膠板放入膠槽中;2）根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內，定量加入電泳緩沖液；3）放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴溴化乙錠（EB）熒光染料,輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液，倒入膠槽中，小心去除其中氣泡，然后插上梳子待其凝固；4）室溫下3045分鐘后凝膠完全凝

8、結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內；5）向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內有氣泡，應設法除去。4對DNA進行電泳在DNA樣品中加入10 x體積的載樣緩沖液（loadingbuffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內；接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負）。一般60100V電壓，電泳2040min即可；根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產(chǎn)物的大小。5熒光下觀察拍照Loadingbuffer是藍

9、色的，在凝膠上出現(xiàn)的藍色的帶是Loadingbuffer的位置而不是DNA的位置，對DNA的觀察需要在紫外燈下，配置凝膠時所加入的溴化乙錠EB含有一個可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團。用標準302nm紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號，可用Polaroid底片或帶CCD成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。實驗結果：DNA凝膠電泳結果分別為：腦，舌，心，肺，肝，腎，胎盤的鋅指蛋白基因和內參基因。分析討論：一電泳結果的分析：首先左側的帶幾乎都出現(xiàn)在同一個位置，這個位置表示的就應該是目的基因接下來比較目的基因對應的內參基因的亮度比如腦和舌組織中的內參基因相同也就是說對應的目的基因的基數(shù)大致相同

10、，那么就可以判斷出在舌組織中鋅指蛋白的表達量大于腦組織；肝組織和胎盤組織的鋅指蛋白表達量幾乎都很少從左側看大致是肝大于胎盤，但是通過比較內參基因發(fā)現(xiàn)肝的內參少于胎盤的，那么總的來說鋅指蛋白在肝中的表達量一定大于胎盤，以此類推可以對各個組織中的表達量進行比較。心臟組織的內參基因可能因為操作不當沒有出現(xiàn)條帶，應重新實驗。通過SNP位點使用酶切法對印記基因的印跡性進行探究原理：1,印記基因簡單來講就是基因通過甲基化.組蛋白的乙?；确绞?，調控基因的表達使基因表達沉默的現(xiàn)象，而且這種基因表達沉默的發(fā)生取決于這個基因來自母本還是父本，其中父本不表達成為父本印記，相反母本不表達稱為母本印記。2，單核苷酸多態(tài)性（SNP）因為某單個堿基的改變造成DNA序列的差異，是造成個體差異的主要原因。3，限制性內切酶，識別特定的NDA序列，在特定位點解開磷酸二脂鍵使DNA被切開成為兩條鏈，形成粘性末端或平末端。4,將待測基因（一定是cDNA）進行PCR然后進行酶切，酶切位點恰選為母本和父本有差異的SNP位點（假設父本可以被切開，母本沒有該酶可以切開的序列）那么在酶切之后對DNA進行凝膠電泳預測的結果如下：假如此基因不是印記基因，那么cDNA中會存在兩條鏈即父本母本都表達，經(jīng)過酶切之后形成沒