實(shí)驗(yàn)一 食品中大腸菌群的測(cè)定

1、大腸菌群(M.R.N.)的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私獯竽c菌群在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的意義學(xué)習(xí)并掌握大腸菌群的檢驗(yàn)原理和方法，以判別食品的衛(wèi)生質(zhì)量二、實(shí)驗(yàn)原理：大腸菌群系指一群能在37r經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭 氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指 標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污 染，同時(shí)間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數(shù)系以每100g (或ml)檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)(the mos t probable number-簡(jiǎn)稱(chēng) MPN)表示。最近似數(shù)(most probable numbe

2、r-簡(jiǎn)稱(chēng) MP N)法是一種將樣品“多次(管)稀釋至無(wú)菌”的計(jì)數(shù)方法。將3個(gè)稀釋梯度的 檢樣稀釋液接種于9支或15支試管培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種3支或5支。經(jīng) 培養(yǎng)后，根據(jù)結(jié)果查閱MPN檢索表，就可得到原樣品中微生物的估計(jì)數(shù)量。M PN測(cè)定方法尤其適用于帶菌量極少、其他方法不能檢測(cè)的食品。如水、乳制品 及其他食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。三、材料1、樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點(diǎn)、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品。2、菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteria aerogenes)3、培養(yǎng)基及試劑單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊

3、脂(EMB)、 革蘭氏染色液、蛋白陳水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱(MA)4、其它設(shè)備和材料溫箱(36 土 1)C、水浴鍋(44 土 0.5)r、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)檢驗(yàn)程序大腸菌群檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖（二）操作步驟采樣及稀釋?zhuān)ň唧w材料）以無(wú)菌操作鮮橙多飲料（具體根據(jù)實(shí)驗(yàn)室提供的確定）25g（或25mL）放于含有225mL 滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng) 充分振搖或研磨做成1： 10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以8000r / mjn- 10000r / min的速度處理

4、1min，做成1： 10的稀釋液。用1mL滅菌吸管吸取1： 10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1： 100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作 10倍遞增稀釋液。根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種 3管。也可直接用樣品接種。乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)即通常所說(shuō)的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。將待校樣品接種子乳糖服鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管1mL及1mL以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管，置（36 土 1）C培養(yǎng)箱內(nèi)， 培養(yǎng)（24 土 2）h

5、，的所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者， 則按下列程序進(jìn)行。如有產(chǎn)生者，則按下列程序進(jìn)行。分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂板，置（36 土 1）C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h24h，：然 后取出，觀(guān)察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)即通常所說(shuō)的證實(shí)試驗(yàn)，其目的在于證明從乳糖初酪管試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)的試管內(nèi)分離 到的革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。在上述的選擇性培養(yǎng)基上，挑取可疑大腸菌群12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖 發(fā)酵管，置（36 士 l）C的溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24 土 2）h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣.革蘭氏染色為陰性反應(yīng)的無(wú)

6、芽胞桿菌，即報(bào)告為大腸桿菌陽(yáng)性； 凡糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色為陽(yáng)性，則報(bào)告為大腸桿菌為陰性。5 .報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表（見(jiàn)表54），報(bào)告每100mL（8）食品中大腸菌群的最可能數(shù)。5.1試驗(yàn)結(jié)果表接種量管號(hào)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果有無(wú)典型菌落革蘭氏染色結(jié)果復(fù)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果最后結(jié)論+或-0.1ml1230.01ml1230.001ml123注：填寫(xiě)初發(fā)酵與復(fù)發(fā)酵結(jié)果應(yīng)以下列符號(hào)表示。-”表示不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基為紫 色；“+”表示只產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基變黃色；“”表示產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，培養(yǎng)基變黃，并 有氣泡。5.2結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查MPN檢索表（見(jiàn)附錄）報(bào)告每10

7、0ml （克）大腸 菌群的最可能數(shù).6.附件1g檢樣中最近似值（MPN使用三管法，接種量分別為0.1, 0.01和0.00lg。大腸菌群MPN檢索表陽(yáng)性管數(shù)MPN95%可信限1ml (g)X30.1ml (g)X30.01ml (g)X3100 ml (g)下限上限00030001305900026000390010305130011600129001312002060021900221200231600309003113003216003319010040520010170102101021101031501107010230111110303601121501131901201103036

8、012115012220012324013016013220024029020090103602011403037020220020326021015030440211200708902122702133402202104047022128010015002223502234202302902313602324402335303002304012003013907013003026401503800303950310430702100311750140230031212003003800313160032093015038003211500300440032221003504700323290033024003601300033146007102400033211000150048000333沱 24000注：本表采用3個(gè)稀釋度0.1g(mL)、0.0lg(mL)和 0.001g(mL),每個(gè)稀釋度接種3管。表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(mL)、0.10(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降 低10倍：如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng) 增加