單基因病的診斷

1、單基因病的診斷第1頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二遺傳病的診斷 ( Diagnosis of Hereditary Disease) 可以分為產(chǎn)前診斷、癥狀前診斷和現(xiàn)癥病人診斷三種類型。遺傳病的診斷是開展遺傳咨詢和防治工作的基礎(chǔ)。第2頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二遺傳病的診斷方法普遍性診斷原則 是指與一般疾病相同的診斷方法，即通過對病史、癥狀、體癥、實驗室檢查和其他診斷技術(shù)所獲得的資料進行歸納分析，同時排除擬診疾病，然后確立診斷。遺傳學(xué)的特殊診斷 主要是指染色體檢查、性染色質(zhì)檢查、特異性酶和蛋白質(zhì)以及代謝中間產(chǎn)物的生化分析、DNARNA以及家系

2、分析、皮膚紋理分析、攜帶者的檢出等等。第3頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二一 病史、家族史和體癥1. 病史由于遺傳病多有家族聚集現(xiàn)象，所以病史的采集的準(zhǔn)確性非常重要。除關(guān)注一般病史外，主要著重于患者的家族史、婚姻史和生育史。第4頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二( 1 ) 家族史 2. 家族史采集家族史時應(yīng)該特別注意因患者或代述人由于文化程度、記憶能力、思維能力、判斷能力以及精神狀態(tài)而使癥狀、體癥的描述不夠準(zhǔn)確、全面，或者因為患者、代述人提供假材料等都會影響家族史的準(zhǔn)確性。著重了解結(jié)婚年齡、次數(shù)、配偶健康狀況以及是否近親結(jié)婚等。第5頁，共58頁，2

3、022年，5月20日，2點19分，星期二 3 . 生育史著重了解生育年齡、子女?dāng)?shù)目、健康狀況、有無流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)史等。如有新生兒死亡或患兒，則除詢問父母及家庭成員上述情況外，還應(yīng)該了解患兒有無產(chǎn)傷、窒息，妊娠早期母體有無患病毒性疾病和接觸過致畸因素，如服用過致畸藥物或接觸過電離輻射或有害化學(xué)物質(zhì)等。第6頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二4. 癥狀和體癥遺傳病除和其他疾病有相同的體癥之外，往往有其本身的特異性癥候群，為診斷提供初步的線索。苯丙酮尿癥：智力發(fā)育不全，特殊腐臭尿液半乳糖血癥：智力發(fā)育不全伴有白內(nèi)障，肝硬化。第7頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，

4、星期二由于大多數(shù)遺傳病在嬰兒和兒童時期即可有體癥和癥狀出現(xiàn)，故除觀察外貌特征外，還應(yīng)該注意身體發(fā)育情況：諸如體重增長速度，智力增進、性器官以及第二性癥發(fā)育、肌肉的張力、嬰兒啼哭的聲音等情況。由于有遺傳異質(zhì)性，若欲作出病因診斷，單憑體癥、癥狀資料是非常困難的，一定要進行必要的實驗室檢查。診斷中應(yīng)該注意的問題第8頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二二、系譜分析系譜 ( Pedigree ) ：將患者家族的所有成員及其發(fā)病情況按照一定格式排繪制成的圖解，就成為系譜。系譜分析 ( Pedigree Analysis ) ：對某種性狀或者疾病的多個系譜 進行綜合研究，從而得出這種性狀

5、或者疾病的遺傳方式，稱之為系譜分析。第9頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二一例并指癥的系譜第10頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二一例多指（趾）的系譜12 2341567123456第11頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二一例-地中海貧血的系譜12213456789812345679101112設(shè)：貧血基因 0 正?；?A A 0A 0A 0A A重型貧血輕型貧血0 0A 0 第12頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二121137645109124128131634215356101112131415一例白

6、化病的系譜第13頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二一例甲型血友病的系譜21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91第14頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二2一例抗維生素D性佝僂病的系譜1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91設(shè)：致病基因XA 正?；騒aXA XaXaYXAYXAXaXAY第15頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二進行系譜分析應(yīng)注意的問題系譜的系統(tǒng)性、完整性、可靠性。去偽存真。分析顯性遺傳病時應(yīng)注意延遲顯性、不規(guī)則顯性、外顯不全等。分

7、析性連鎖遺傳病時應(yīng)注意與從性和限性遺傳相區(qū)別。要注意顯隱性的相對性。因為同一種遺傳病采用不同觀察指標(biāo)會得出不同的結(jié)論。注意新的基因突變。第16頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二HbA HbA HbA HbS HbS HbS 正常人 攜帶著 患者（致死） 無 有（50%） 有（全部） 無 有（生存力強） - 基因型 疾 病 （隱性）鐮形細(xì)胞 （顯性）抗 瘧 疾 （顯性）第17頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二三、生物化學(xué)檢查基因突變引起的單基因病往往表現(xiàn)在酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)與量的改變或者缺如。因此酶和蛋白質(zhì)的定量分析是診斷單基因病和先天性代謝性的主要方法。

8、第18頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二1. 代謝產(chǎn)物的檢出酶的缺陷導(dǎo)致一系列生化代謝紊亂，從而導(dǎo)致代謝底物、中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物、旁路代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。因此，檢測某些代謝常物的質(zhì)和量的改變，可以間接反映出酶的變化而作出診斷。苯丙酮尿癥 ：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病 ：尿中的硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素。DMD ：血清中的磷酸肌酸酶活性。第19頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二2. 酶和蛋白質(zhì)的分析基因突變導(dǎo)致的單基因病主要是特定的蛋白質(zhì)、酶的質(zhì)和量改變的結(jié)果。因此對酶的活性和蛋白質(zhì)含量的測定是確定某些單基因病的主要方法。第20頁，共58頁，20

9、22年，5月20日，2點19分，星期二檢測材料的主要來源有： 特定的組織和細(xì)胞，如肝細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞，腎，腸粘膜細(xì)胞等。注意的問題：一種酶的缺乏不一定在所有組織中都能夠檢測出來。例如苯丙氨酸羥化酶必須用肝組織活檢，而血細(xì)胞中無法得到。第21頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二上海：19811987年對284,396名新生兒進行PKU篩查，查出PKU患兒15名，高苯丙氨酸血癥4名。生物化學(xué)檢查 苯丙酮尿癥, PKU酶活性檢查 PAH 肝細(xì)胞血液濾片法 Guthrie test 血液FeCl3顯色反應(yīng) 苯丙酮酸 尿液第22頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星

10、期二四、基因診斷基因分析，即基因診斷 ( Gene Diagnosis )： 是利用DNA 分析技術(shù)直接從基因水平 ( DNA or RNA ) 檢測遺傳病的基因缺陷。這種方法和傳統(tǒng)的診斷方法主要差別在于直接從基因型推斷表型，可以越過基因產(chǎn)物，直接檢測基因的結(jié)構(gòu)而作出診斷，改變了傳統(tǒng)的表型診斷方式，所以又稱為逆向診斷 ( Reverse Diagnosis )。第23頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二第24頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二1978年，Kan YW 鐮狀細(xì)胞貧血癥狀前診斷 外周靜脈血產(chǎn) 前 診 斷 孕早期的絨毛細(xì)胞 孕中期的羊水胎兒脫

11、落細(xì)胞 母親外周血中的胎兒有核紅細(xì)胞植入前診斷 受精卵卵裂細(xì)胞基因診斷第25頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二基因診斷的優(yōu)點材料容易獲得，不受細(xì)胞類型的限制；不受基因表達的時空限制。不受年齡的限制；可以于發(fā)病前做出診斷；方便有效，迅速準(zhǔn)確，攜帶者也可以有效檢出。第26頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 基因診斷的難點：對大多數(shù)疾病尚未找到合適的基因診斷方法，另外由于遺傳異質(zhì)性、基因突變的多樣性，一種基因診斷方法對同一疾病往往有很大差異。 基因診斷的對象：一般是指單基因病和某些有主基因改變的多基因病。 至1997年，發(fā)現(xiàn)人類單基因病遺傳病已達8587種

12、，現(xiàn)已達到15988種第27頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二進行基因診斷必須具備的條件：(1)致病基因的染色體定位已明確(2)致病基因的結(jié)構(gòu)、順序與突變性質(zhì)巳清楚(3)致病基因與DNA多態(tài)存在連鎖關(guān)系根據(jù)所具備的條件選擇適合的基因診斷技術(shù)第28頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二基因診斷方法 目前常用的基因診斷方法: (1)聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴增法 (2)限制性酶譜Southern印跡雜交直接分析法 (3)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)連鎖分析法 (4)寡核苷酸探針(oligonucleotide probe)檢測法 (5)DNA測序 (6)基因芯

13、片第29頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二（一） 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是在體外特異和迅速地擴增特定靶DNA序列的方法第30頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二PCR的原理：1. 為可選擇性擴增,要有特異引物2. 要有前身物、聚合酶和離子3. 是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，每一周期經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步4. 一周期后DNA倍增第31頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 PCR的過程： 變性（92-95；1分鐘） 復(fù)性（40-60；1分鐘） 延伸（72；1.5分鐘）第32頁，

14、共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 5 3 3 5 變性 5 3 3 5 特異引物 復(fù)性 5 3 5 3 3 5 3 5 DNA聚合酶 延伸 3 5 5 3 PCR第33頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 以地貧基因診斷為例 由于中國人地貧80%以上為東南亞型缺失型 （- -SEA/）, 該突變的缺失范圍約20kb基因片段。因此， 采用跨越斷裂點PCR法（gap-PCR）,一次即可診斷出各種基因型。PCR的應(yīng)用第34頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二第35頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二1 21 2第36頁，

15、共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二Multi-PCR第37頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR產(chǎn)物單鏈DNA凝膠電泳技術(shù)。1 2 3 4 5a b1：正常人； 2,4,5：純合體患者； 3：雜合體(2的弟弟)左為泳動變位模式：a 正常人；b 純合體患者第38頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二PCR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCAC第39頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二第40頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 PCR-DHPLC

16、DHPLC（變性高效液相色譜）進行基因突變檢測的原理 DHPLC進行基因突變檢測是基于異源雙鏈的形成和不同的雙鏈與吸附拄的結(jié)合牢固程度不同。第41頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 一個雜合子個體，PCR產(chǎn)物一定含有野生型和突變型兩種DNA，并且兩者的比例為1:1，將PCR產(chǎn)物進行變性復(fù)性過程，雜交會形成同源雙鏈和異源雙鏈，同樣，當(dāng)把野生型和突變型PCR產(chǎn)物混合后，進行變性復(fù)性過程，雜交后會出現(xiàn)四種情況。第42頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 異源雙鏈由于堿基對不匹配，在部分變性的溫度條件下，就會在不匹配的堿基對處部分解鏈，由于單鏈DNA帶負(fù)電荷減

17、少，結(jié)合力弱，因此，異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來，根據(jù)柱子保留時間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，出現(xiàn)不同的檢測峰。第43頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 DHPLC的特點： 1）快速分離DNA分子，一般進行基因突變檢測，一個樣品約需8.8分鐘 2）自動化操作系統(tǒng) 3）準(zhǔn)確測定DNA片段大小 4）基因突變檢出率高，達95-100% 5）經(jīng)濟、操作簡便、PCR產(chǎn)物無須進行純化處理即可用于突變檢測 第44頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二（二）分子雜交第45頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 Southern印跡雜交 (South

18、ern blot hybridization)原理: DNA堿基的替換和數(shù)目的改變可導(dǎo)致限制性酶切片段長度改變 1. 點突變至酶切位點消失或出現(xiàn)新切點 2. 較大片段堿基缺失 3. 串聯(lián)重復(fù)數(shù)目較大的改變 4. 較大片段堿基重復(fù)第46頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二限制酶的識別序列與切割： 絕大多數(shù)型限制酶的識別序列都是 回文結(jié)構(gòu), 即以雙對稱軸按5 3方向閱讀時,其堿基順序在雙鏈上相同 BamH識別GGATCC 5-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT- 3 3-CCTAGGTACCT TGGCATCGCCTAGGATCA- 5 Bgl識別AGA

19、TCT 5-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3 3-TCTAGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATCA-5第47頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 探針的種類和標(biāo)記 雜交探針 DNA cDNA 寡核苷酸基因組DNA 或PCR產(chǎn)物 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄 化學(xué)合成 雙鏈 0.1-20kb 雙鏈 0.1-10kb 單鏈 15-150bp缺口平移，隨機引物，PCR缺口平移，隨機引物，PCR類型來源特征標(biāo)記 末端標(biāo)記第48頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二 探針標(biāo)記(probe labeling) 同位素標(biāo)記: 32P, 35S

20、, 3H 非同位素標(biāo)記: 生物素，地高辛標(biāo)記方法: 缺口平移 雙鏈探針標(biāo)記 隨機引物 PCR 寡核苷酸標(biāo)記: 5末端標(biāo)上標(biāo)記物第49頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二1限制性酶譜直接分析法： 應(yīng)用專一性基因探針和限制性內(nèi)切酶，經(jīng) Southern印跡雜交直接檢測致病基因存在 原理： 限制性內(nèi)切酶能識別 DNA中特定核苷酸順序，在正常情況下某種限制性內(nèi)切酶所切出的片段長度是固定的，當(dāng)基因發(fā)生突變后, 核苷酸順序發(fā)生改變, 導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶的酶切位點改變，從而使片段長度發(fā)生改變。第50頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二直接分析法鐮狀細(xì)胞貧血(HbS)： 第6位密碼子ATAA AS SSMst: CCTNAGG 1.2 Kb 0.2Kb1.40 Kb1.20 Kb0.20 KbA: CCTGAGGAGS: CCTGTGGAG第51頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二/ / / - - / - - - - / - -第52頁，共58頁，2022年，5月20日，2點19分，星期二RFLP連鎖分析Neurofibroma, NF1 RFLP連鎖分析1 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 84.7 kb3.0 kb?第53頁，共58頁，2022年，5月20