原核生物基因表達調(diào)控分析課件

1、原核生物基因表達調(diào)控分析原核生物基因表達調(diào)控分析主要內(nèi)容一、基因表達調(diào)控的基本概念： 二、 基因表達調(diào)控的理論與模式；主要內(nèi)容一、基因表達調(diào)控的基本概念： 一、基因表達調(diào)控的基本概念：1、基因表達調(diào)控的意義：原核生物對環(huán)境的適應(yīng)、對營養(yǎng)條件改變適應(yīng)的相關(guān)應(yīng)答，都是基因表達的結(jié)果；真核生物的細胞分化, 組織特化 , 個體發(fā)育以及環(huán)境對個體表型的影響都是通過基因表達實現(xiàn)的。2、 基因表達的調(diào)控的方式：transcriptional level（轉(zhuǎn)錄水平）；posttranscriptional level（轉(zhuǎn)錄后水平）；translational level（翻譯水平）；posttranslati

2、onal level （翻譯后水平）。一、基因表達調(diào)控的基本概念：1、基因表達調(diào)控的意義：2、 基轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要發(fā)生在起始時期。通常不在轉(zhuǎn)錄延伸階段進行調(diào)控，但可在終止階段進行調(diào)控。在細菌中，一個mRNA的合成和它的翻譯基本上是同時進行的。翻譯通常在其起始和終止階段進行調(diào)控。3、為了區(qū)分調(diào)控過程中的調(diào)控成分和其調(diào)控的基因，又使用結(jié)構(gòu)基因(Structural gene)和調(diào)控基因(Regulator gene) 的概念。結(jié)構(gòu)基因是編碼蛋白質(zhì)或RNA的任何基因。結(jié)構(gòu)基因編碼大量結(jié)構(gòu)和功能各異的蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白、具有催化活性的酶和調(diào)控蛋白。調(diào)控基因：是編碼調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)基因，該蛋白可以調(diào)控

3、其它基因的表達。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要發(fā)生在起始時期。通常不在轉(zhuǎn)錄延伸階段進行調(diào)4、順式作用(cis-acting)元件：指不轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌魏涡问?，只在原位發(fā)揮調(diào)控作用，僅影響與其在物理上相連的基因表達的一段DNA序列。順式作用元件通常和啟動子并列或散布在其周圍。經(jīng)常與啟動子相鄰的一個順式作用位點稱為操縱基因(Operator)，它是調(diào)控蛋白：阻遏蛋白或激活蛋白的靶位點。當(dāng)阻遏蛋白（或激活蛋白）和操縱基因結(jié)合時，就會阻止（或激活）RNA 聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄，操縱基因下游的結(jié)構(gòu)基因表達會因此被關(guān)閉（或開放）。4、順式作用(cis-acting)元件：指不轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌魏?、原核生物和真核生物的基因的組織形式

4、差異很大，細菌的功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因一般成簇(Cluster)排列，而真核生物的基因則是獨立存在。原核成簇排列的結(jié)構(gòu)基因能受單一啟動子共同控制：結(jié)果使整套基因或者表達或者都不表達。5、原核生物和真核生物的基因的組織形式差異很大，細菌的功能相6、 生物遺傳信息的概念Genome DNA10%; 結(jié)構(gòu)基因的編碼序列 triplet codon90%; 重復(fù)，間隔，調(diào)節(jié)序列作用：基因選擇性表達指令； 重要的遺傳信息。遺傳信息的兩大類別II類；特定DNA seq. + 特定蛋白質(zhì)/ 核酸結(jié)合基因表達的指令 gene on / offI類；DNA seq. RNA seq. (codon) aa seq.

5、 protein phenotype（性狀） 6、 生物遺傳信息的概念Genome DNA10%; 結(jié)構(gòu)7、調(diào)控的關(guān)鍵是調(diào)控基因編碼蛋白質(zhì)與與DNA 上的特異位點（順式反應(yīng)位點）的結(jié)合來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)控基因在DNA上的位點一般位于所調(diào)控基因的上游。這種相互作用可以通過兩種方式進行：正(Positive) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控：如果在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是關(guān)閉的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因被轉(zhuǎn)錄表達，這樣的調(diào)控是正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。該調(diào)節(jié)蛋白稱為激活蛋白。負(Negative) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控：在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是表達的，加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因表達活性便被關(guān)閉，這樣的調(diào)控稱為負轉(zhuǎn)錄調(diào)控。該調(diào)節(jié)蛋白稱為阻

6、遏蛋白。7、調(diào)控的關(guān)鍵是調(diào)控基因編碼蛋白質(zhì)與與DNA 上的特異位點（8、 遺傳信息表達的方式 組成型表達（constitutive expression）Housekeeping gene 適應(yīng)性表達(adaptive expression）Luxury gene8、 遺傳信息表達的方式 組成型表達（constitut 指其表達幾乎不受環(huán)境變動而變化的一類基因。該類型基因通常被稱為管家基因(housekeeping gene)。2）、適應(yīng)性表達：指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。 應(yīng)環(huán)境條件變化，基因表達水平增高的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)(induction)，這類基因被稱為可誘導(dǎo)的基因(i

7、nducible gene)。如果某種物質(zhì)能夠促使細菌產(chǎn)生某種酶來分解它，這種物質(zhì)就是誘導(dǎo)物。（分解代謝）1）、組成性表達： 指其表達幾乎不受環(huán)境變動而變化的一類基因。該類型基因通常相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏(repression)，相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因(repressible gene)。如果某種物質(zhì)能夠阻止細菌產(chǎn)生合成這種物質(zhì)的酶，這種物質(zhì)就是輔阻遏物。（合成代謝）安慰誘導(dǎo)物：如果某種物質(zhì)能夠誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生某種酶而本身又不被分解，這種物質(zhì)被稱為安慰誘導(dǎo)物，如IPTG（異丙基- D-硫代半乳糖苷）。相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達水平降低的現(xiàn)象稱為阻遏(rep8

8、、基因表達的規(guī)律 時間性和空間性1）、時間特異性（temporal specificity）按功能需要，某一特定基因的表達嚴(yán)格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性。多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stage specificity)。 8、基因表達的規(guī)律 時間性和空間性2、空間特異性(spatial specificity)空間特異性實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cell or tissue specificity)。在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達的空間特異性。2、空間特異性(spat

9、ial specificity)空間一）、 transcriptional level control Prok. operon stringent response應(yīng)急反應(yīng) attenuator 衰減子1、Operon control (1961 Jacob. & Monod.)二、 基因表達調(diào)控的理論與模式一）、 transcriptional level cont 各結(jié)構(gòu)基因按一定比例協(xié)調(diào)翻譯 ( Z : Y : A = 5 : 2 : 1 ) P & O基因(cis)緊密連鎖 或 彼此重疊 I 基因(trans) 位點不固定，編碼一種反式作用因子，可以調(diào)控Z、Y、A結(jié)構(gòu)基因的表達。含自

10、己的啟動子和終止子。1）、 operon concept定義：是基因表達的協(xié)調(diào)單位，由啟動子、操縱基因及其所控制的一組功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因所組成。操縱基因受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的控制。Lac operon I p o Z Y A 例如： 特點： 各結(jié)構(gòu)基因按一定比例協(xié)調(diào)翻譯 ( Z : Y : A 2）、 operon control type Negative & Positive I geneNeg.Pos.i- or 不加入I基因產(chǎn)物 operon onI+ or 加入I基因產(chǎn)物 operon off i- or 不加入I基因產(chǎn)物 operon off I+ or 加入I基因產(chǎn)物 operon

11、on repressor NegativePositiveexpressor (apoinducer)無輔基誘導(dǎo)物（激活蛋白）（阻遏蛋白）（阻遏蛋白）（激活蛋白）2）、 operon control type Operon off Negative control 一般是原核生物利用的調(diào)控方式，是一種廣泛保險的機制，使原核生物更好的適應(yīng)外界營養(yǎng)條件的變化。 Positive control 一般是真核生物喜歡利用的調(diào)控方式。是一種靈活，嚴(yán)格，經(jīng)濟的調(diào)控機制 意味轉(zhuǎn)錄效率極低 Repressor binding on O siteExpressor binding front p site阻止轉(zhuǎn)

12、錄啟動激活轉(zhuǎn)錄啟動阻遏蛋白激活蛋白 Operon off Negative contr3）、Model Signal molecular be needed for both typesAdd signal mol. Operon onAdd signal mol. Operon offCo-repressorInducer(inducible operon)(repressible operon)（共阻遏物）（誘導(dǎo)物）3）、Model Signal molecular b負控轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)負控誘導(dǎo)調(diào)節(jié)負控阻遏調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），阻止了結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。阻遏蛋白與效

13、應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合，使阻遏蛋白失活，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄；阻遏蛋白與效應(yīng)物（輔阻遏物）結(jié)合，使阻遏蛋白產(chǎn)生活性，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。正控轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)正控阻遏調(diào)節(jié)正控誘導(dǎo)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使失去活性的激活蛋白處于活性狀態(tài)；效應(yīng)物分子（輔阻遏物）的存在使有活性的激活蛋白處于非活性狀態(tài)。原核生物基因表達調(diào)控方式：負控轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)負控誘導(dǎo)調(diào)節(jié)負控阻遏調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏Operon control modelOperon control modelA、 Negativeinducible operon 例 (分解酶類 lactose operon)

14、I gene active repressorIbinding on Operator38 kd / monomertetramer 152 kd例如：在Lactose operon中A、 Negativeinducible operon 大腸桿菌乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)： 大腸桿菌乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)：Lac. Operon structureLac. Operon structureZ編碼-半乳糖苷酶：將乳糖（1，4糖苷鍵）水解成葡萄糖和半乳糖Y編碼-半乳糖苷透過酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細胞壁和原生質(zhì)膜進入細胞內(nèi)。A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶：乙酰輔酶A上的乙酰基轉(zhuǎn)到-半乳糖苷上

15、，形成乙酰半乳糖。Z編碼-半乳糖苷酶：將乳糖（1，4糖苷鍵）水解成葡萄糖和原核生物基因表達調(diào)控分析O gene (operator) cis-action factormRNA startpointunwinding RNA polymerase binding Repressor bindingO & P overlap repressor & RNA polymerase bindat sites that overlap around the start point of Lac operonrepressor & RNA polymerase 對重疊位點競爭O gene (operat

16、or) cis-action-調(diào)控機理Inducer (lactose) 與repressor 特異結(jié)合tetramer 變構(gòu) 特異結(jié)合力下降1000X作用于 O位點上的repressor 變構(gòu) 脫離O位作用于游離的repressor operon on無誘導(dǎo)劑時：repessor tetramer與operator發(fā)生特異結(jié)合 operon off 變構(gòu) 失去結(jié)合于O位的能力當(dāng)培養(yǎng)基中有誘導(dǎo)劑時：-調(diào)控機理Inducer (lactose) 與repr調(diào)控機理調(diào)控機理調(diào)控機理調(diào)控機理w.t. (I+ O+ P+) 誘導(dǎo)型add inducer operon on no inducer ope

17、ron offOC失去與repressor特異結(jié)合的能力OC mut. (I+ OC P+) constitutive mut. （組成型）w.t. (I+ O+ P+) 誘導(dǎo)型add inducer組成型突變： lacOc 組成型突變： lacOc iC mut. (iC O+P+) constitutive mut. (組成型)iC gene產(chǎn)物repressor喪失與O位點結(jié)合的能力iS mut. (iS O+P+) super-repression mut. (超阻型)iS gene 產(chǎn)物repessor 不能與inducer結(jié)合iC mut. (iC O+P+) constituti

18、ve組成型突變： iC 組成型突變： iC 不可誘導(dǎo)突變（超阻遏）：不可誘導(dǎo)突變（超阻遏）：兩個問題：1、lac操縱子的本底水平表達有兩個矛盾是操縱子理論所不能解釋的：誘導(dǎo)物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而轉(zhuǎn)運誘導(dǎo)物需要透過酶，后者的合成有需要誘導(dǎo)。解釋：一些誘導(dǎo)物可以在透過酶不存在時進入細胞？ 一些透過酶可以在沒有誘導(dǎo)物的情況下合成？兩個問題：1、lac操縱子的本底水平表達真正的誘導(dǎo)物是異構(gòu)乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖甘酶的預(yù)先存在。解釋：本底水平的組成型合成：非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量的lac mRNA合成。真正的誘導(dǎo)物是異構(gòu)乳糖而非乳糖，前者是在

19、-半乳糖甘酶的催2、葡萄糖對lac操縱子的影響 如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中， lac操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能被誘導(dǎo)；一旦耗盡外源葡萄糖，乳糖就會誘導(dǎo)lac操縱子表達分解乳糖所需的三種酶。該現(xiàn)象稱為葡萄糖效應(yīng)其原因是代謝物阻遏效應(yīng)。2、葡萄糖對lac操縱子的影響 如果將葡萄糖和乳糖同時B、 Negativerepressible operon (合成酶類) tryptophan synthease operon R gene inactive repressor Co-repressor ( tryptophan ) 色氨酸是一系列酶促反應(yīng)的終產(chǎn)物共阻遏物B、 Negativerepre

20、ssible operontrpR P O E D C B AtrpR P O E D C B Atryptophan調(diào)控機理Operatoroperon offoperon onrepressor + trp active repressorRepressor (inactive ) can not bind on the O site (trp absent)trpR P O w.t. (I+O+P+) 阻遏型iC mut. ( iCO+P+ constitutive mut. )OC mut. ( I+OCP+ constitutive mut. ) iC inactive repres

21、sor can not be activated by co-repressorOC can not be bound by activated repressorw.t. (I+O+P+) 阻遏型iC mut. ( iCOInactive expressoractive expressorC、Positiveinducible operon (多為分解酶類)I inactive expressoroperon offinduceractive expressorbinding on front P site激活RNA polymerase啟動w.t. (I+O+P+) 誘導(dǎo)型iS mut.

22、超阻突變 (super-repression)expressor can not be activated by induceroperon off（失活的激活蛋白）Inactive expressoractive expree.g. cAMP control (universal controlling system)Lac operon open but no transcriptsGlucoseWhy?LactoseE.coli當(dāng)大腸桿菌在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)葡萄糖和乳糖時，它分解利用葡萄糖，而抑制乳糖的利用。這種選擇是通過阻止包括乳糖操縱子、半乳糖操縱子和阿拉伯糖操縱子等的表達來實現(xiàn)的。這種作

23、用被稱為分解代謝產(chǎn)物阻遏(Catabolite repression)作用。e.g. cAMP control (universal cATPppp c AcAMPp c A 5-AMPp c AI (cap gene)(catabilite gene activator protein)+細胞中葡萄糖水平低，葡萄糖代謝中間產(chǎn)物L(fēng)ac.Operon I P O腺苷酸環(huán)化酶激活細胞中葡萄糖水平升高激活磷酸二酯酶二聚體激活聚合酶ATPppp c AcAMPp cAMPCAP 具有廣泛生理效應(yīng)的正控制系統(tǒng)存在于多種基因表達調(diào)控體系中Lac operon expressioncAMP( Positiv

24、e-inducible )lactose( Negative-inducible ) cAMPCAP 具有廣泛生理效應(yīng)的正控制系統(tǒng)Lac opactive expressorcoexrepressorD、Positiverepressible controlI active expressor (apoinducer) operon onCo-repressorInactive expressoroperon offw.t. (I+O+P+) 阻遏型iS mut. inactive expressor 不能激活RNA pol. 轉(zhuǎn)錄不能啟動（正控阻遏調(diào)節(jié)）active expressorcoe

25、xrepressorDArabinose operon (regulon araC = I )CAPcAMPC o p o B A D po E po F G與結(jié)合，運輸相關(guān)的膜結(jié)合蛋白ABDL核酮糖L核酮糖5磷酸D木糖5磷酸+阿拉伯糖 （inducer）E、基因表達綜合調(diào)控實例異構(gòu)酶核酮糖激酶表異構(gòu)酶Arabinose operon (regulon operon regionCO2 PC O1 I1 I2 PBAD B A DCAPcAMP site-280 -146 -90 +1cisFactorPCRNA pol. binding site transcription on left

26、for araCI1,I2 Cpind binding site transcription for araBADO1,O2 Cprep binding site repression for PBAD & PCPBADRNA pol. binding site transcription on right for araBADoperon regionCO2 PC O1TransFactoraraC(I)Cp bifunctions（雙功能）(araCrep &araCind )當(dāng)Cp過量且無ArabinoseCp as repressor (Cprep) binding on I+O1+O

27、2當(dāng)Cp 過量, 且有arabinose, 有CAPcAMPCp as expressor (Cpexp) or (Cpind) binding with RNA pol. on I1+ I2通常； Cprep -平衡- Cpind when no arabinose Cprep Cpindadd arabinose Cprep + arabinosePC & PBAD offCpind + I1 + I2 PBAD onCpind調(diào)控過程：TransFactoraraC(I)Cp bifuncti-Cp 合成的自我調(diào)控（auto-regulation）CprepC O2 Pc O1 I1 I

28、2 PBAD B A DC O2 Pc O1有Ara. / 無Cp / 無Glu.CAP-cAMPCprepArabinose-Cp 合成的自我調(diào)控CprepC O2 C-P repC-P repC-P repPc CO2O1I1 I2 PBAD B A D無Ara. / 有Cp / 有Glu.C O2 Pc O1 I1 I2 PBAD B A DoffoffC-P repC-P repC-P repPc Arabinose operon open BAD gene expressionAra. PresentcAMP enough (no glucose)Cp present Cpind總之

29、：Arabinose operon open BAD gene2、 stringent response control1）、 基本概念 應(yīng)急反應(yīng)(Stringent response)：細菌處于極差的生長條件下，由于缺乏足夠的氨基酸，蛋白質(zhì)合成受到抑制，因而會關(guān)閉大量的代謝過程，這就是應(yīng)急反應(yīng)或應(yīng)急調(diào)控。 stringent response 是對任何氨基酸饑餓時表現(xiàn)的 一種廣泛的調(diào)節(jié)機制。2、 stringent response contr stringent response control2）、 相關(guān)因子 stringent factor ( Rel gene （松弛基因） pyro

30、phosphate transferase（焦磷酸轉(zhuǎn)移酶）應(yīng)急因子催化鳥苷-5-二磷酸-3-二磷酸(ppGpp)和鳥苷-5-三磷酸-3-二磷酸(pppGpp)的合成。該因子與核糖體相結(jié)合，但正常情況下，量很少。 stringent response control2）、3) stringent response 分子機理Rel + stringent factoruncharged tRNA in A sitePPGATP AMPppGpppppGppNull tRNA , 肽鏈不延伸，ATP不斷消耗signal molecular10 upIdling reaction(空載 tRNA)（空

31、載反應(yīng)） 應(yīng)急反應(yīng)底觸發(fā)：細胞核糖體A 位點上空載tRNA的增多。 根據(jù)是否獲得氨酰-tRNA,核糖體進行肽鏈合成或進行下一個空載反應(yīng)。3) stringent response 分子機理Re 抑制rRNA, tRNA轉(zhuǎn)錄 放慢轉(zhuǎn)錄延伸過程 放慢蛋白質(zhì)合成過程 啟動氨基酸合成基因Idling reaction緊縮開支，度過難關(guān) signal molecularppGpp + RNApol RNA pol.不易變構(gòu) RNApol的構(gòu)象穩(wěn)定 聚合酶不能識別大部分啟動子 導(dǎo)致大部分基因轉(zhuǎn)錄的停止。 應(yīng)急反應(yīng)的作用: 抑制rRNA, tRNA轉(zhuǎn)錄 放慢轉(zhuǎn)錄延伸過程 當(dāng)細菌的生存條件恢復(fù)正常時，一種名為

32、spoT 的基因編碼降解ppGpp 的酶。它能以約20 秒的半衰期快速將ppGpp 降解； 應(yīng)急反應(yīng)能隨著(p)ppGpp的消失很快逆轉(zhuǎn)； spoT 突變株能提高ppGpp 的水平，結(jié)果生長緩慢。 應(yīng)急反應(yīng)的消除： 當(dāng)細菌的生存條件恢復(fù)正常時，一種名為spoT 的基因編碼降4、 Attenuator control 1) discovery E.coli trp synthetase operon ( Charles Yanofsky stanford .U ) Negativerepressible operon 發(fā)現(xiàn)的原因：高濃度trp和低濃度trp的表達水平相差600倍，而阻遏作用僅能使

33、轉(zhuǎn)錄降低70倍。I P O leading seq. E D C B Atrp+（弱化子）4、 Attenuator control 1) disc 1968. Imamato Lab.僅有少量 trp時，RNApol啟動，但在L.S.處脫落，轉(zhuǎn)錄中斷I P O leading seq. E D C B A少量trp+不足以結(jié)合 O 位點 1968. Imamato Lab.僅有少量 tr 1975 Imamato Lab. E.coli trp-AARS (tryS5突變型：trp-AARS30度有活性，42度該酶失活）w.t. 30 trpEt.s.mut. 42 trpE當(dāng)有少量trp

34、供應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)下列現(xiàn)象。trp-tRNAtrpprotein 合成TrptRNAtrp30 42 Nothingt.s.(42)t.s.(30)w.t.(30) w.t.(42)trpEWhy?AARS野生型：兩個溫度下，trpE都受到抑制；突變型：42度下，trpE活性。 1975 Imamato Lab. E.coli t.s.(42) AARS 失活 無trp-tRNAtrp 合成 RNApol 經(jīng)過L.S（前導(dǎo)序列） 轉(zhuǎn)錄trp合成酶RNA t.s. (30), w.t.(30), (42) AARS 正常 有 trp-tRNAtrp合成RNApol在L.S. （前導(dǎo)序列）處脫落 trp

35、合成酶RNA未轉(zhuǎn)錄 t.s.(42) AARS 失活 RNApol 經(jīng)過結(jié)果表明；-細胞內(nèi)只要有trp,有 trp-tRNAtrp 存在 就不合成trp (表現(xiàn)一種精細調(diào)控)- t.s.(42) 因無AARS, 無trp-tRNAtrp, 卻誤以為無trp, 通過前導(dǎo)區(qū)，啟動轉(zhuǎn)錄trp合成酶RNA -trp-tRNAtrp是引起RNApol 在L.S. 處脫落的主要因子結(jié)果表明；-細胞內(nèi)只要有trp,有 trp-tRNAtr leading sequence中存在精細微調(diào)的機制I+; operon off E酶活低 i C ; operon on E酶活高(70倍)trpa+與trpa-的 E

36、 酶活差異(10倍)在于Leading seq.I po L.S. E D C B Agenotype I+ iCtrpa+ 0.17 11.8trpa- 1.82 100When rich trp測定E 酶活Controls the operon over a 700-fold range from full inactive to full active leading sequence中存在精細微調(diào)的機S.D. Seq14 amino acid leader peptidestopUGAtrp E2) trp operon RNA 一級結(jié)構(gòu)分析 114121126134 (palindr

37、omic seq.) with poly (U) 2768 base ORF of 14aa 140 base RNA almost binding with protein (translable seq.) trp high frequency with 1/7 in 14 aa(2個） 114 121 126 134 1402768Trp 1/7S.D. Seq14 amino acid leader p不同氨基酸合成酶操縱子引導(dǎo)肽的 氨基酸序列 在每種含有弱化子的氨基酸代謝操縱子中，前導(dǎo)肽中含有幾個該氨基酸。不同氨基酸合成酶操縱子引導(dǎo)肽的 在每種含有弱化子的氨基酸代3) 調(diào)控機制分析1

38、-2 / 3-42 - 33) 調(diào)控機制分析1-2 / 3-42 - 3RNA 聚合酶停留在衰減子的哪個部位取決于核糖體的位置，而核糖體的位置還決定著序列3、4能否形成終止發(fā)夾的終止子結(jié)構(gòu)。RNA 聚合酶停留在衰減子的哪個部位取決于核糖體的位置，而核衰減子控制著RNA聚合酶能否進入Trp基因。聚合酶在啟動子處起始后行進至+90 處，這時如果色氨酸缺乏，它會越過+140 的衰減子進入結(jié)構(gòu)基因；如果有足量的色氨酸，衰減子發(fā)生作用，90%的聚合酶行進至衰減子處就游離下來，產(chǎn)生一個140bp 長的引導(dǎo)肽mRNA。衰減子控制著RNA聚合酶能否進入Trp基因。聚合酶在啟動子處4) Attenuator c

39、ontrol 的生物學(xué)意義原核生物細致的精細調(diào)控機制，增強原核生物對環(huán)境的適應(yīng)性衰減作用約10倍作用于轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)色氨酸存在時，終止有效，衰減子使得只有約10%的RNA聚合酶能繼續(xù)參與轉(zhuǎn)錄。在缺乏色氨酸時，所有的RNA聚合酶都經(jīng)過衰減子繼續(xù)參與轉(zhuǎn)錄。加上取消阻遏增加的約70 倍的表達，缺乏色氨酸時，色氨酸操縱子表達量增強約700 倍。4) Attenuator control 的生物學(xué)意5、因子的更換 在E.coli中,當(dāng)細胞從基本的轉(zhuǎn)錄機制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達時，需要不同的因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合。5、因子的更換大腸桿菌中的各種因子比較因子編碼基因主要功能70rpoD參與對數(shù)生長期

40、和大多數(shù)碳代謝過程基因的調(diào)控54rpoN參與多數(shù)氮源利用基因的調(diào)控38rpoH分裂間期特異基因的表達調(diào)控32rpoS熱休克基因的表達調(diào)控28rpoF鞭毛趨化相關(guān)基因的表達調(diào)控24rpoE過度熱休克基因的表達調(diào)控大腸桿菌中的各種因子比較因子編碼基因主要功能70rpo溫度較高,誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白 由32參與構(gòu)成的RNA聚合酶與熱休克應(yīng)答基因啟動子結(jié)合,誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的熱休克蛋白,適應(yīng)環(huán)境需要枯草芽孢桿菌芽孢形成 有序的因子的替換,RNA聚合酶識別不同基因的啟動子,使芽孢形成有關(guān)的基因有序地表達溫度較高,誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白枯草芽孢桿菌芽孢形成二）、 post-transcriptional l

41、evel control1 pre-RNA processing (for Eukaryotes only)2 RNA interference (RNAi ) 廣泛存在于原核生物（E.coli） 到真核真核生物（plant-mammalian） 二）、 post-transcriptional leve1）、 RNA interference (RNAi )的發(fā)現(xiàn)與證實重要的意外發(fā)現(xiàn)（Su Guo 1995 康乃爾大學(xué)）抑制秀麗新小桿線蟲胚胎對稱性基因（par-1）Par-1基因表達特異性阻斷Par-1基因表達未被增強反而發(fā)生了特異性阻斷？！mRNA (ck) anti-mRNA 秀麗新小桿

42、線蟲injection1）、 RNA interference (RNAi )的Andrew Fire (1998.2 華盛頓卡耐基研究院)mRNA 制備中污染微量D.S RNA特異性地降解mRNA of par-1 injection C.elegans Interruption expression of par-1證明；Dr. Su Guo mRNA of Par-1 純化的 S.S mRNA of par-1 c.elegans 極微弱抑制純化的 D.S mRNA of par-1 c.elegans 特高效抑制 Named RNA interference (RNA 干涉) Andr

43、ew Fire (1998.2 華盛頓卡耐基研究院 RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默的機制 注射D.S Exon mRNA 被干涉 注射D.S Intron or promoter seq. mRNA 不被干涉 D.S RNAi 具有極高的干涉特異性 僅降解與其相應(yīng)的mRNA成為21-26小mRNA片斷 D.S RNAi 具有極高的干涉效率 極少的D.S RNAi 可達到較對照高達2個數(shù)量級 表型可達到缺失突變體效應(yīng) 可能存在干擾效應(yīng)分子的擴增機制 D.S RNAi 的效應(yīng)可穿過細胞傳遞，可在世代間遺傳 干 涉 的 特 征RNA RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默的機制 D.S RNAi 具干涉 的

44、可能機制RNA 細胞中一組特異蛋白質(zhì) D.S RNA結(jié)合依賴RNA的RNA聚合酶 復(fù)制D.S RNARNAse III 降解D.S RNA at U 21-25nt sD.S RNA 25nt具有與對應(yīng)mRNA足夠的序列同源性（短雙鏈RNA）干涉 的可能機制RNA 細胞中一組特異蛋白質(zhì) 干涉 的可能機制RNA 21-25nt sD.SRNA+蛋白質(zhì)復(fù)合體 結(jié)合 mRNAIf. sD.S RNA的無義鏈與mRNA不互補Complex way out from mRNAIf. sD.S RNA的無義鏈與mRNA發(fā)生互補 交換 mRNA置換sD.S RNA的有義鏈 RNAase III 從sD.S

45、RNA的無義鏈一端切斷mRNA 25nt干涉 的可能機制RNA 21-25nt sD.SRNA+蛋白干涉 的可能機制RNA25nt mRNA 與sD.S RNA無義鏈、蛋白質(zhì)結(jié)合，形成復(fù)合體，啟動新一輪切割干涉 的可能機制RNA25nt mRNA 與sD.S RNA干涉 的可能機制RNA RNA干涉一旦啟動，就可將對應(yīng)的mRNA 全部降解，達到缺失突變的效應(yīng) sD.S RNA也可降解pre-RNA, 但機率較低。 25nt sD.S RNA 極易穿過細胞，進行遠距 離的轉(zhuǎn)移，并可進入生殖細胞傳遞下一代 原因：由于pre-RNA存在時間短，同時有加工蛋白的結(jié)合，阻止干涉復(fù)合體的結(jié)合。干涉 的可能

46、機制RNA RNA干涉一旦啟動，就可將對應(yīng)的mRRNAi研究的意義 合成并注射特異 sD.S RNA 功能基因組理論研究 大規(guī)模的基因突變不同發(fā)育階段注射 發(fā)育生物學(xué)理論研究抗病毒的sD.S RNAi 單抗、多抗，保護動、植物 在表型上達到的遺傳效應(yīng)相當(dāng)于基因敲出 RNAi研究的意義 合成并注射特異 sD.S RNA 三）、Translational level control1. 重疊基因?qū)peron內(nèi)各基因以一定比例的協(xié)調(diào)翻譯的影響： Trp操縱子五個基因在正常時，翻譯效率是相等的； 但TrpE基因突變時，導(dǎo)致其下游相鄰的TrpD翻譯效率下降，而距離較遠的TrpB和TrpA基因的翻譯效率

47、不受影響； 由于E和D基因有部分重疊，可以保證E和D基因翻譯量是相等的。P O I E D C B A UGA AUG UGA AUG三）、Translational level control3. InformasomemRNA + 自身翻譯產(chǎn)物infomasome儲存信息(mRNA儲存于卵細胞中，受精后迅速翻譯蛋白)綿羊的受精卵第四次卵裂前核基因不表達，利用卵細胞質(zhì)中儲存的mRNA完成細胞分裂2. 利用稀有密碼子對操縱子中的基因翻譯進行調(diào)控 對蛋白質(zhì)翻譯速率的調(diào)控-NNN-codon usage 低 tRNA少，停工待料，翻譯速率慢3. InformasomemRNA + 自身翻譯產(chǎn)物in

48、4. 蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控 -蛋白質(zhì)與自身mRNA結(jié)合,進行自體調(diào)控 E.coli 組成核糖體的蛋白50種以上一個核糖體內(nèi)（除L7/L12具有4個分子外）其他蛋白均僅為1個分子 一個細胞內(nèi)EF-Tu因子的分子數(shù)是核糖體數(shù)的10倍 核糖體蛋白的合成與rRNA合成也是嚴(yán)格協(xié)調(diào)的； 現(xiàn)象：4. 蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控 E.coli 組成核糖體的蛋白5協(xié)調(diào)機制 不同的核糖體蛋白基因組裝并分布在不同的operon中； 每個operon內(nèi)都有一個核糖體蛋白作為自身operon的調(diào)節(jié)蛋白； 在operon的mRNA上具有與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的位點； （靠近或包含S.D. Seq ） 該位點與在組裝核糖體時 核糖體蛋

49、白與 rRNA結(jié)合的位點高度同源， 并具有相似的二級結(jié)構(gòu)； 調(diào)節(jié)蛋白與rRNA的結(jié)合力高于與自身mRNA的結(jié)合力； operon 中有些基因 受該系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 有些基因具有各異的調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)合位點，受另外體系控制；協(xié)調(diào)機制 不同的核糖體蛋白基因組裝并分布在不同的operonrDNAGAGGAL11 L1L11 operonGAGGAmRNA當(dāng)rRNA充足時當(dāng)rRNA不足時regulatorGAGGA關(guān)閉核糖體蛋白合成（翻譯水平上）rDNAGAGGAL11 L1L11 5. mRNA 的壽命對翻譯的調(diào)節(jié) 原核生物中mRNA半衰期較短，一般為2-3分鐘 （頻繁更新，適應(yīng)環(huán)境） 真核生物中不同基因mR

50、NA半衰期相差很大 降解速率明顯不同 5. mRNA 的壽命對翻譯的調(diào)節(jié) 原核生物中m+ 5 3 6. mRNA 二級結(jié)構(gòu)對翻譯的調(diào)節(jié) 例如：RNA virus R17 A-p : C-p = 1 : 180 A Rep C AUG of A-p gene hide in D.S. region gene exposed on S.S.region AUG of C-p 通過對翻譯起點的控制，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成量及比例 + 5 5( - RNA) 5 3 5 A C-p be translated first Rep-p be translated (replication enzyme) C-

51、p translation continue Rep-p binding on 3 of +RNA synthesis RNA chain of R17 (180) 5( - RNA) 5 3 5 A C-p be t(1) A-p be translated by new +RNA But as template only for very short time . New + RNA form A “flower” of second structure And AUG of A-p gene closed 3 (-) 5 5(+) 3 (-) 5 A 5(+)(1) A-p be tra

52、nslated by new +7. anti-sense RNA control protein translation反義RNA(anti sense RNA)：是指mRNA互補的RNA分子。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結(jié)合，從而抑制該mRNA的加工與翻譯，是原核細胞中基因表達調(diào)控的一種方式。然而，許多實驗證明，在真核細胞中亦存在反義RNA，但其功能尚未全部明了。A、定義：7. anti-sense RNA control prB、反義RNA阻止大腸桿菌基因表達實例： 大腸桿菌中編碼外膜蛋白的基因ompF的表達受培養(yǎng)基滲透壓的控制。 滲透壓的增加激活受體EnvZ，受體又激活O

53、mpR，OmpR 激活調(diào)控基因micF (mRNA-interfering complementary RNA) mRNA的轉(zhuǎn)錄。 MicF的產(chǎn)物是一個174 堿基的RNA。是ompF mRNA 的反義RNA?？梢宰柚筼mpF mRNA 的翻譯。B、反義RNA阻止大腸桿菌基因表達實例： 大腸桿菌中編碼外膜 micF RNA 的合成關(guān)閉了ompF mRNA 的翻譯的機制： micF RNA與ompF mRNA 分子中含有核糖體結(jié)合位點的翻譯起始區(qū)域互補。因此micF RNA 能發(fā)揮調(diào)控物的功能，與ompFmRNA 結(jié)合，阻止其翻譯。 它也能與ompF mRNA 形成雙螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，使ompF mR

54、NA 不穩(wěn)定，使它對水解雙鏈的核糖核酸酶敏感。 micF RNA 的合成關(guān)閉了ompF mRNA 的翻譯大腸桿菌摩爾滲透壓濃度增加激活并產(chǎn)生了OmpR，OmpR 誘導(dǎo)micF 的轉(zhuǎn)錄，micF RNA(反義)與ampF 5 互補，阻止其翻譯。大腸桿菌摩爾滲透壓濃度增加激活并產(chǎn)生了OmpR，OmpR 誘反義基因在耐儲藏番茄育種中的應(yīng)用 ACC gene ( 1-氨基丙環(huán)烷羧酸氧化酶， 乙烯合成途徑酶類) anti-sense ACC-mRNA ACC-mRNA 乙烯合成被抑制 (-) 5 3 mRNA(-) 5 3(+) 3 5 cDNAanti-sense ACC gene pCaMV35s-

55、pCaMV35s-反義基因在耐儲藏番茄育種中的應(yīng)用 ACC gene ( 1-8. Attenuatorlike （弱化子樣因子） in translation leading peptide emrC mRNA 5-AUG 23s rRNA G2057AMAMG2060 Bacterial emrC coding methylase of 23s rRNA 抗紅霉素 2 of IR region of translation attenuatorlike 甲基化酶8. Attenuatorlike （弱化子樣因子） emrC IR1 IR2 19 aa Leading Peptide AUG

56、 of emrC mRNA emrC IR1 IR2 19 aa Leading P無紅霉素時有紅霉素時emrC AUG on emrCAUG offL. Peptide translatedRibosome stop in aa5-9 23s rRNA mathylase23s rRNA被甲基化細菌表現(xiàn)抗紅霉素?zé)o紅霉素時有紅霉素時emrC AUG on emrCL. emrC mRNA有與23s rRNA相似的與emrC-p結(jié)合的位點，當(dāng)emrC-p過量時，emrC-p 與自身mRNA 結(jié)合，控制翻譯； 當(dāng)23SrRNA都被甲基化后，核糖體不再結(jié)合紅霉素， emrC mRNA 也不再翻譯，e

57、mrC的mRNA又處于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的關(guān)閉中。 emrC mRNA的關(guān)閉： emrC mRNA有與23s rRNA相似的與emrC-四）、 Gene expression control in post-translation level1. protein secretion（分泌）1）、蛋白質(zhì)合成方式-游離的核糖體 In Euk.-核糖體附著在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (rough endoplasmic reticulum RER)蛋白質(zhì)合成擴散在細胞質(zhì)內(nèi)進入cis-Golgibody inter-golgibody選擇， 加工，分泌，擴散tran-golgibody合成蛋白質(zhì)高爾基體中間高爾基體反面四）、

58、 Gene expression control1. In Prok. - 核糖體附著在細胞內(nèi)膜（inner membrane）游離型與分泌型合成蛋白質(zhì)的核糖體 在結(jié)構(gòu)與功能上沒有差別通過外膜合成蛋白質(zhì)穿過內(nèi)膜進入間質(zhì)（periplasm）擴散到細胞外 In Prok. 游離型與分泌型合成蛋白質(zhì)的核糖2）、蛋白質(zhì)分泌的信號肽假說 （signal hypothesis） Blobel in Prok. & Euk. 1971. 1975 1530 aa leading seq. in N-end of secretory protein Leading seq named as signal s

59、eq & signal hypothesis2）、蛋白質(zhì)分泌的信號肽假說 Blobel in Pr signal Seq.引導(dǎo)的穿膜機制-signal S. 帶正電的區(qū)段與帶負電的磷脂膜互作,引導(dǎo) 蛋白質(zhì)進入 inner M.+ + + + +- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -內(nèi)膜 signal Seq.引導(dǎo)的穿膜機制-signal - 疏水區(qū)段嵌入磷脂膜內(nèi)或形成helix,- 并對磷脂雙層膜產(chǎn)生擾動效應(yīng)，- 誘發(fā)形成非脂雙層結(jié)構(gòu)， 以保證Signal S. 所牽引的蛋白質(zhì)順利穿膜CNCN- 疏水區(qū)

60、段嵌入磷脂膜內(nèi)或形成helix,CNCN signal S. 的切除； peptides folding； Glucosylation （糖基化：受體對配體的識別）； Phosphorylation （磷酸化：酶類的功能活化）； Acetylation (乙?；悍忾]N 末端，改變電荷)； Methylation (甲基化：改變電荷) ； 蛋 白 質(zhì) 穿 膜 后 的 加 工 signal S. 的切除； peptides foldi2. protein degradation1）、protein degradation 的調(diào)控是生理代謝的需要各類蛋白的半衰期幾乎恒定e.g. in liver