微生物及無菌知識培訓、六步洗手法及進入潔凈車間的程序

1、微生物及無菌知識培訓一、前言 我們所生活的環(huán)境中，到處都存在著大量的微生物。在一般空氣中，微生物達8003500個/m3，在土壤中達1500108個/g，在嚴重污染的水中可達107個/ml。（飲用水要求細菌總數(shù)100個/ml，大腸桿菌3個/ml。經(jīng)水塔或貯水池貯存后，短期內(nèi)可繁殖至105106個/ml。）人的頭皮上有140萬個/cm2，兩手上約有440萬個，1g指甲污垢有38億個，1g糞便可達101000億個?？梢哉f微生物是無處不在，無處不有。許多以前被人們認為是極端（高溫、高壓、強酸、強堿、低溫等）甚至是致死的環(huán)境，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)生活著各種類型的微生物（稱為極端微生物）。事實說明，微生物有特別頑

2、強的生存、繁殖和變異能力來適應環(huán)境。 微生物種類繁多，有的對人有益，有的有害，有的無益也無害。但在藥品生產(chǎn)過程中，不可能對環(huán)境中的各種微生物加以區(qū)別對待，為保證藥品的安全有效，需要對其進行控制?？諝庵械奈⑸锒鄶?shù)附著在灰塵上，或以芽孢形式懸浮于空氣中，1m以下者處于懸浮狀態(tài)，10m以上者會逐漸沉下來而形成菌塵。所以也要對塵粒進行控制。 人是潔凈室最大的污染源，占90%左右。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個以上的含菌粒子，女性為750個以上。穿無菌服時，靜止時的發(fā)菌量為10300個/min，一般活動時發(fā)菌量為1501000個/min，行走時發(fā)菌量為9002500個/min?？人砸淮伟l(fā)菌量為

3、70700個/min，噴嚏一次為400060000個/min。所以在潔凈室中，人的數(shù)量和活動應有特別嚴格的限制。 微生物是廣泛存在于自然界的一群體形微?。ㄖ睆叫∮?mm）、結構簡單、肉眼看不見，必須藉助光學或電子顯微鏡放大數(shù)百至數(shù)萬倍才能觀察到的生物。需要說明的是，微生物是一個比較籠統(tǒng)的概念，界線有時非常模糊。如單細胞藻類和一些原生動物也應算是微生物，但通常它們并不放在微生物中進行研究。微生物具有以下特點：體積小，面積大；吸收多，轉化快（2000倍體重/h）；生長旺，繁殖快（20min分裂一次）；易變異，適應強；分布廣，種類多（10萬種以上）。 微生物按其結構、化學組成及生活習性等差異可分成三

4、大類：1真核細胞型細胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體；胞質(zhì)內(nèi)有完整的細胞器（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及線粒體等）。真菌屬于此類型微生物。2原核細胞型細胞核分化程度低，僅有原始核質(zhì)，沒有核膜與核仁；細胞器不很完善。這類微生物種類眾多，有細菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體和放線菌。二微生物簡介3非細胞型沒有典型的細胞結構，亦無產(chǎn)生能量的酶系統(tǒng)，只能在活細胞內(nèi)生長繁殖。體積微小，能通過除菌濾器。病毒屬于此類型微生物。 微生物在自然界中的分布極為廣泛，空氣、土壤、江河、湖泊、海洋等都有數(shù)量不等、種類不一的微生物存在。在人類、動物和植物的體表及其與外界相通的腔道中也有多種微生物存在。 絕大多數(shù)微生物

5、對人類和動、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多種元素循環(huán)靠微生物的代謝活動來進行。例如空氣中的大量氮氣只有依靠微生物的作用才能被植物吸收，土壤中的微生物能將動、植物蛋白質(zhì)轉化為無機含氮化合物，以供植物生長的需要，而植物又為人類和動物所利用。因此，沒有微生物，植物就不能新陳代謝，而人類和動物也將無法生存。 另一方面，由極少數(shù)微生物引起的傳染病發(fā)病快、死亡率高、傳播迅速、傳播范圍廣，嚴重危害著人民健康。1細菌（原核單細胞生物）細菌按形狀可分為：球菌（0.52m）、桿菌（長15m，寬0.31m）和螺形菌（大小與桿菌相似）。按革蘭氏染色法染色的不同，分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏

6、陽性菌的細胞壁表面含較多的磷壁酸，會產(chǎn)生外毒素，如金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌的細胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖，會產(chǎn)生內(nèi)毒素（即熱原），如大腸桿菌。細菌一般有細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核，有的還有莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊結構。細菌一般為無性繁殖，以二分法繁殖，幾十分鐘或12小時分裂一次。2霉菌（絲狀真菌的通稱，真核多細胞生物） 霉菌是真菌的一部分。在培養(yǎng)基上長成絨毛狀或棉絮狀的菌絲體的真菌統(tǒng)稱為霉菌。三微生物的形態(tài)結構 霉菌細胞呈狹長的管狀，稱為菌絲。菌絲直徑比細菌、放線菌大，約210m。菌絲分枝連接，交錯集合在一起的總體稱為菌絲體。霉菌大多數(shù)是多細胞微生物，菌絲細胞由細胞壁、細胞膜、細胞

7、質(zhì)、細胞核和各種細胞器組成。細胞壁很薄，往往在表面產(chǎn)生色素，使菌落出現(xiàn)各種顏色。霉菌靠孢子繁殖，有無性繁殖和有性繁殖兩種方式，以無性繁殖為主。 3酵母菌（真核單細胞生物，屬真菌） 酵母菌以單細胞存在，呈圓形、卵圓形和香腸形，比細菌大，細胞長530m，寬15m。細胞結構有細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核和各種細胞器等。酵母菌的增殖分無性繁殖和有性繁殖兩個階段，有三種方式：芽殖、裂殖、孢子生殖。 4放線菌（原核單細胞生物） 放線菌有生長發(fā)育良好的菌絲體，呈分枝狀，菌絲寬為0.21.2m，革蘭氏陽性。其內(nèi)部構造與細菌相似，無完整的細胞核。菌落常呈幅射狀，因此稱放線菌。 繁殖方式為無性孢子繁殖。最適pH

8、6.77.5，溫度2530。放線菌可用于生產(chǎn)抗生素、維生素和酶類，少數(shù)可引起人畜放線菌病。5病毒 病毒是一類體積十分微小，結構簡單，只含一種核酸（DNA或RNA），沒有產(chǎn)生能量的酶系統(tǒng)，只能在活細胞內(nèi)以復制方式增殖的非細胞型微生物。病毒在自然界分布非常廣泛，在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常見的致病微生物，人類傳染病中大約75%是由病毒引起的。 病毒體主要由核酸和蛋白質(zhì)組成。病毒體積微小，最大直徑300nm（如牛痘病毒），最小直徑20nm（如口蹄疫病毒），絕大多數(shù)在 150nm以下，能通過細菌濾器，用普通光學顯微鏡看不見，必須用電子顯微鏡放大數(shù)千至數(shù)萬倍才能看見。形態(tài)多呈球形，少數(shù)為桿狀

9、或磚形。噬菌體（細菌病毒）有呈蝌蚪狀的。四微生物的營養(yǎng) 1水分：水占細胞漿的70%90%，是細胞的重要組成成分。較普遍的觀點認為：只有在含水的環(huán)境中微生物才能存活。但也有人發(fā)現(xiàn)在無水碳氫化合物中微生物可長期2碳源：碳源是構成細胞的重要物質(zhì)。有些微生物的碳源必須來自有機碳化合物如糖、蛋白質(zhì)、脂肪、有機酸等（同時利用其化學能），屬異養(yǎng)型；有些微生物不需有機碳化合物，以CO2為碳源，屬自養(yǎng)型（分為光能自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型）。3氮源：氮是組成蛋白質(zhì)和核酸的重要元素。4無機鹽類：細菌所需無機鹽包括磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、氯、錳、鋅、鈷、銅等。其中磷、硫、鎂、鉀、鈉、鐵需要量較多，其他只需微量。5生長因

10、子：生長因子是某些微生物生長發(fā)育所必需，而其自身又不能合成的一類營養(yǎng)物質(zhì)。包括維生素、嘌呤和嘧啶等。 五微生物生長的影響因素1營養(yǎng)物2pH值：各種微生物都有其最適宜的pH值，大多數(shù)細菌最適pH為6.87.4，但一般有較大的容忍度，在49也可存活和生長，少數(shù)細菌能在極端pH值范圍內(nèi)生長。真菌適于pH值36的微酸性環(huán)境，但在210也可生長。3溫度：微生物適于生長繁殖要有適宜的溫度，當超過其最低或最高可耐受的溫度時，即停止生長或死亡。一般細菌最適溫度為 3040，真菌為2030。4氧氣：大多數(shù)細菌和所有霉菌都是需氧菌（在有氧環(huán)境中才能生長），少數(shù)細菌是厭氧菌（在無氧環(huán)境中才能生長），有些細菌和酵母菌

11、是兼性需氧厭氧的，在有氧或無氧環(huán)境中都能生長繁殖。5滲透壓：微生物細胞膜和所有生物膜一樣是一種半透膜，可讓水自由通過，對溶質(zhì)則有選擇性。由于細胞壁的保護，微生物能存活在低滲透壓的水中。而在高滲溶液（如高濃度的鹽溶液或糖溶液、40%甘油）中，細胞會脫水并停止生長繁殖。但也有一些專性耐高鹽細菌只有在高鹽（1015%）條件下才生長。6表面張力：表面活性劑可降低表面張力它是影響細菌生長的因素之一。很多革蘭氏陰性菌，特別是大腸菌群可很好地在表面活性劑包圍的介質(zhì)中生長，而大多數(shù)革蘭氏陽性菌在表面張力低時（0.05N/m）不能很好生長。陽離子表面活性劑對很多有機體有毒性，陰離子表面活性劑毒性很小，非離子表面

12、活性劑幾乎沒有毒性，并可成為某些微生物的營養(yǎng)物。六消毒與滅菌消毒與滅菌是微生物實驗技術中最基本的操作，從事藥品生產(chǎn)和檢驗的人員都應當了解消毒與滅菌的方法及其意義，嚴格遵守操作規(guī)程，否則會影響產(chǎn)品質(zhì)量，危害患者安全。1概念無菌不存在活的生物（GMP指南）。 “無菌”從定義上來說是一個絕對的概念，但遺憾的是，在科學和技術高度發(fā)展的今天，藥品的絕對無菌即做不到，也無法加以證實。然而，無菌制劑的安全性要求人們設定無菌的相對標準。FDA、歐洲制藥工業(yè)界曾將百萬分之一微生物污染率作為滅菌產(chǎn)品“無菌”的相對標準，它和蒸汽滅菌后產(chǎn)品中微生物存活的概率為10-6（即產(chǎn)品的無菌保證值為6），系同一標準的不同表示法

13、。這一標準于1980起收錄于USP XX中，如今已為世界各國普遍接受和采用。滅菌使達到無菌狀態(tài)的方法（GMP指南南）。用物理或化學方法殺滅傳播媒介上所有的微生物，使其達到無菌（GB）。通常是指殺滅或除去全部活的微生物（包括繁殖體和芽孢）。消毒用物理或化學方法殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使其達到無害化（GB）。通常是指殺死病原微生物的繁殖體，但不能破壞其芽孢。所以消毒是不徹底的，不能代替滅菌。 無菌制劑不存在活的微生物的制劑（GMP指南）。 非無菌制劑所含活的微生物量符合衛(wèi)生學標準的制劑（GMP指南）。2常用消毒劑消毒劑常用量用途乙醇 70%75%水溶液 0.5%洗必泰溶于70%乙醇，再加

14、入2%甘油 用于皮膚、器具等消毒 異丙醇 75%水溶液 用于皮膚、器具等消毒 甲醛 37%40%甲醛液89ml，再加入45g高錳酸鉀 每m3熏蒸量，密閉1224h。刺激性強戊二醛 2%水溶液 用于空氣、器具等消毒。廣譜、高效、低毒，可殺芽孢和病毒。刺激性較輕。新潔爾滅（苯扎溴銨） 0.1%水溶液 用于皮膚、粘膜、器具等消毒，有清潔和消毒雙重功效?？咕V較窄。 杜滅芬（消毒寧） 0.05%0.1%水溶液 用于皮膚、器具等消毒過氧乙酸 0.2%0.5%水溶液 新配0.5%水溶液 1g/m3 用于器具等消毒抗菌譜廣，可用于皮膚消毒殺滅某些病毒熏蒸但性質(zhì)不穩(wěn)定乳酸 0.331mol/L 11.5ml/

15、m3熏蒸或與等量苯酚合用熏蒸 噴霧，用于空氣消毒，有強殺菌作用熏蒸，密閉12h以上麝香草酚 5%麝香草酚溶于50%乙醇 噴灑墻面、地面，殺霉菌3常用滅菌法1）干熱滅菌法常見的有火焰、燒灼、干烤和紅外線滅菌等?；鹧?、燒灼：通常用于實驗室無菌操作中金屬或其它耐火材料制成的器具的滅菌。干烤和紅外線：利用干熱空氣或熱輻射進行滅菌。一般135145需35h，160170需2h以上，170180需1h以上，180200需0.51h。除熱原則需25030min，或20045min，1802h?？諝鈧鳠崧?，穿透力不強，故干熱滅菌時間長。干熱滅菌時烤箱內(nèi)裝入物品應留有空隙，以利空氣流動，否則使箱內(nèi)溫度不均，部分

16、物品滅菌不徹底。 2）濕熱滅菌法通過熱蒸汽或沸水使蛋白質(zhì)變性而殺滅微生物的方法。濕熱穿透力強，滅菌效果較干熱好。煮沸或流通蒸汽滅菌：常壓下沸水和蒸汽的溫度是100，一般處理3060min可殺死細菌繁殖體，但不能完全殺滅芽孢。此法適用于不能高壓蒸汽滅菌的物品。低溫間隙滅菌（巴斯德滅菌法）：將物品先用6080加熱（或煮沸）1h，然后置2025保存24h（或常溫過夜），使其中殘存的芽孢萌發(fā)成繁殖體，再用以上條件滅菌，如此反復三次。本法適用于不耐高溫或高溫下易變質(zhì)的物品，但很費時。高壓蒸汽滅菌（熱壓滅菌法）：超過一個大氣壓時，水的沸點高于100，反之亦然。 高壓蒸汽滅菌就是通過加壓提高蒸汽溫度，滅菌效

17、果最好。它簡便、經(jīng)濟、可靠、無毒，是最可靠、應用最廣泛的滅菌法。此法適用于耐高溫和潮濕的物品。常用條件為：115.5 30min121.5 20min126.5 15min注意事項：a. 必須完全排出滅菌器內(nèi)的空氣。否則會影響滅菌器內(nèi)溫度達到規(guī)定的要求。b. 注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內(nèi)溫度與被滅菌物品的溫度一般是一致的，但在蒸汽輸入過快時，后者可能低于前者，所以升溫時要有一定的預熱時間。另外，降溫過快易引起玻璃炸裂。因此，對于一種滅菌產(chǎn)品，應制定一固定的滅菌曲線（象凍干曲線一樣）。c. 定期檢查滅菌器內(nèi)溫度的準確性。3）化學滅菌法利用化學試劑形成的氣體來殺滅微生物的方法。常用的滅菌劑為環(huán)氧

18、乙烷（又稱氧化乙烯）。環(huán)氧乙烷是廣譜殺菌劑，能殺滅細菌、芽孢和多種病毒，還能殺死昆蟲及蟲卵。但由于環(huán)氧乙烷易燃易爆且有毒（有致變異性），用于藥品方面極有限，多用于醫(yī)療器械、塑料制品等滅菌。（不能用于橡膠和乳膠手套，能將其溶解。）4）濾過除菌法利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理，除去對熱不穩(wěn)定的藥品溶液或液體物質(zhì)中的細菌的方法。過濾法一般只能除菌，不能除去支原體和病毒。過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關。濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22m。由于各廠家生產(chǎn)的相同規(guī)格的濾膜質(zhì)量并不一致，為了保證除菌效果，在使用前后應檢查濾器的完好性（如壓力維持試驗或起泡點試

19、驗）。一個過濾器的使用時間應根據(jù)品種驗證后確定，一般不應超過8小時。5）輻射滅菌法輻射有兩種類型：一種是電磁波輻射，如紫外線、紅外線、微波；一種是電離輻射，如可引起被照射物電離的X射線、射線。紫外線：紫外光波長在136390nm之間，其中260nm左右能破壞核酸，殺菌作用最強。另外，空氣中的氧受紫外線照射后，可微量轉變?yōu)槌粞豕餐饸⒕饔?。紫外線消毒的效果與光源的功率、光源與被照射物的距離、照射時間、溫度和濕度等因素有關。我國規(guī)定紫外燈照射強度在距離1m處不低于70W/cm2（以紫外線測強儀測定）。在操作面上要求強度達40W/cm2以上。一般每10m2裝30W燈管1支，工作前開3060min。

20、紫外燈的輸出功率隨使用時間增加而降低。國產(chǎn)紫外燈的平均壽命（點到70%額定功率的時間）一般為2000h，超過平均壽命時，就達不到預期效果，必須更換。紫外線的穿透力很弱，不能穿透一般包裝材料，如玻璃、塑料薄膜、紙等。玻璃能強烈吸收小于350nm的紫外線，石英玻璃能吸收小于200nm的紫外線。因此，它主要用于空氣和物體表面消毒，特制的紫外燈裝置也可用于水的消毒。紫外線對眼、皮膚有損壞，照射過程中產(chǎn)生的臭氧對眼、鼻腔有刺激，臭氧過多時使人頭暈、胸悶、血壓下降。紅外線：通過加熱碳化硅板產(chǎn)生的輻射熱能，由空氣傳導加熱滅菌。如紅外線烤箱，溫度可達180左右。熱效應特點是由表及里。微波：微波滅菌主要是因其熱

21、效應。微波加熱升溫快，溫度高且均勻，殺菌作用強。熱效應特點是由里及表。不同性質(zhì)的物品吸收微波的能力不同，其熱效應和消毒效果也不同。微波有一定穿透力，但不強。微波對人體有害，要注意防護。60Co滅菌：放射性同位素60Co（或137Cs）衰變時可放射出射線，射線的能量高、穿透力強，可使細胞內(nèi)各種活性物質(zhì)發(fā)生化學變化，從而使細菌損傷或死亡。經(jīng)60Co輻射滅菌的物品溫度升高很少，一般僅約5，故又稱“冷滅菌”。60Co輻射存在兩個方面的安全問題：一是輻射的直接作用。射線對人體細胞同樣有害；二是經(jīng)過輻射的食品、藥品的安全性。1984年美國農(nóng)業(yè)部食品安全實驗室用輻射處理的雞肉喂飼小鼠，發(fā)現(xiàn)患*腫瘤增加，包括加重癌病損害。因此60Co輻射用于食品和藥品都應經(jīng)過安全試驗，進行科學的、全面的評價，高劑量的輻射藥品更應慎重。 美國藥典規(guī)定25kGy為有效滅菌劑量。1997年我國衛(wèi)生部頒發(fā)了60Co中藥滅菌標準，該標準限國內(nèi)流通中藥可用60Co輻照滅菌，規(guī)定了允許輻照的藥材和中成藥的品種和劑量。中藥輻照最大吸收劑量標準：散劑 3kGy片劑 3kGy丸劑 5kGy中藥原料粉 6kGy附錄：1藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）的空氣潔凈度等級（GMP1998）潔凈度級別 塵粒最大允許數(shù)（個/m3