弓形蟲烯醇化酶基因的克隆與表達

1、 本科畢業(yè)論文 題 目 弓形蟲烯醇化酶2基因的克隆與表達 學 院 生命科學技術(shù)學院 專 業(yè) 生物技術(shù)（動物方向） 畢業(yè)屆別 2014屆 姓 名 謝國華 指導教師 劉霞 副教授 張德林 研究員 甘肅農(nóng)業(yè)大學教務(wù)處制二一四年五月目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc356393746 摘要 III雙酶切鑒定和PCR鑒定，切出約為1 335 bp的片段，與克隆的目的基因大小相符，表明成功的構(gòu)建了pMD-ENO2重組質(zhì)粒。（見圖1） 圖1. ENO2基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of ENO2 geneM. DNA標準分子量

2、；1.RT-PCR擴增產(chǎn)物M. DL2000 DNA Marker; 1. PCR product of SAG1 gene;3.2 pMD-ENO2重組質(zhì)粒的酶切鑒定 pMD-ENO2重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Hind 雙酶切鑒定和PCR鑒定，切出約為1 335 bp的片段，與克隆的目的基因大小相符，表明成功的構(gòu)建了pMD-ENO2重組質(zhì)粒。（見圖2） 圖2. PMD-18t-ENO2酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD-ENO2 by digestion with EcoR I +Hind M：分子質(zhì)量標準；1. ENO2基因

3、PCR產(chǎn)物； 2.pMD-18T-ENO2 EcoRI單酶切； 3.pMD-18T-ENO2 Hind III單酶切；4.pMD-18T-ENO2 EcoR I/Hind III雙酶切；5.pMD-18T-ENO2重組質(zhì)粒M. DL2000 DNA Marker; 1.PCR product of ENO2 gene; 2. pMD-18T-ENO2 digested with EcoR I 3.pMD-18T-ENO2 digested with Hind ；4.pMD-18T-ENO2 digested with Hind /EcoR I； 5：Recombinant plasmid pM

4、D-18T-ENO23.3 pET-ENO2重組質(zhì)粒的鑒定以重組質(zhì)粒pMD-ENO2為模板，PCR擴增的目的片段約為1 335 bp。經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，用PCR擴增和雙酶切（EcoR I和Hind）進行鑒定。產(chǎn)生兩個片段，大小分別與酶切后的載體、PCR產(chǎn)物大小符合（圖3），表明成功的構(gòu)建了pET30a-ENO2重組質(zhì)粒。 圖3 重組質(zhì)粒pET30a-ENO2的酶切鑒定Fig. 3 Identification of recombinant plasmid pET30a-ENO2 by restrictive enzymes digestionM.分子質(zhì)量標準1.ENO2基因PCR產(chǎn)物；2.pET3

5、0a（+）；3.pET30a-ENO2重組質(zhì)粒；4.pET30a-ENO2 EcoRI/HindIII雙酶切；5.pET30a-ENO2 EcoRI單酶切；6.pET30a-ENO2 HindIII單酶切；M. DL10 000 and DL2 000 DNA Marker；1. PCR product of ENO2 gene； 2. pET30a（+）3. Recombinant plasmid pET30a-ENO2； 4. pET30a digested with EcoRI/Hind III；5. pET30a-ENO2 digested with EcoRI;6. pET30a-E

6、NO2 digested with Hind III3.4 ENO2基因表達產(chǎn)物SDS分析重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導，表達產(chǎn)物進行SDS膠分析，出現(xiàn)48 kD的蛋白帶，與理論值相符。結(jié)果如圖4所示。圖4.ENO2表達產(chǎn)物的SDS電泳分析Fig.4 SDSanalysis of the expressed recombinant ENO2M.蛋白分子質(zhì)量；1.未誘導產(chǎn)物；2.誘導產(chǎn)物M.Protein molecular weight Marker;1.No IPTG induction;2.Expressed products4 討論本實驗中重組質(zhì)粒的誘導表達采用異丙基硫

7、代半乳糖苷（IPTG），是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應(yīng)用。在有IPTG誘導物存在的條件下，誘導物可與阻遏蛋白結(jié)合成復(fù)合物，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，阻遏蛋白就不能與O基結(jié)合，從而促進基因表達，提高表達量。IPTG在不同濃度，溫度，誘導時間條件下，對表達產(chǎn)物量具有顯著影響，本實驗中IPTG終濃度為1.0 mmol/L，在37 誘導表達，3 h后收集菌液，經(jīng)SDS電泳檢測，從圖4中可知：成功得到表達產(chǎn)物，且表達量較高。弓形蟲的生理代謝均來自于糖酵解，本文所分析的弓形蟲烯醇酶雖不屬于糖酵解中的關(guān)鍵酶，卻是該途徑中的一個重要酶類，在細胞的能量代謝中具有重要的作用。同時

8、它又是一種多功能的蛋白:它具有熱休克蛋白的功能7-10;能與細胞骨架蛋白和多聚核葺酸結(jié)合11；是纖溶酶原、層粘連蛋白的受體等10。己經(jīng)證實，作為寄生蟲分泌排泄抗原之一的烯醇酶可能參與了寄生蟲與宿主之間的相互作用、因此可以確定該酶在寄生蟲的能量代謝及與宿主之間的作用中具有很高的研究價值12。很多研究發(fā)現(xiàn)烯醇酶定位于細菌、真菌、原蟲、蠕蟲的表面，而分布在表膜的蛋白有可能成為藥物的靶分子，或是診斷抗原的候選分子。此研究為弓形蟲的診斷、藥物及疫苗研究提供線索。本研究對弓形蟲ENO2基因進行克隆表達，為下一步研制基于排泄分泌抗原的抗弓形蟲重組疫苗奠定基礎(chǔ)。參考文獻（Reference）:1 趙云鶴.剛地

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