微生物可行性報告完整版

1、重組 HSV- 新型溶瘤病毒疫苗可行性報告學(xué) 院 ： 生物工程學(xué)院專業(yè)班級：生工 1501 班學(xué)生姓名：呂永斌指導(dǎo)教師：裘娟萍摘要 ： 經(jīng)過重組減毒的型溶瘤單純皰疹病毒在體外具有良好的溶瘤效果，經(jīng)過研究，目前已經(jīng)能建立以Vero 細胞為基質(zhì)的重組HSV 一病毒疫苗反應(yīng)器微載體無血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝，最大病毒滴度可達到6.62 lgTCID50 ml 以上。 為以 Vero 細胞為基質(zhì)的無血清病毒疫苗規(guī)?；囵B(yǎng)提供了一種簡便、高效的工藝方法，可計劃用于工業(yè)化生產(chǎn)。關(guān)鍵詞 ： 重組 HSV- ； Vero 細胞；生物反應(yīng)器；微載體培養(yǎng)正文：產(chǎn)品的意義：目前惡性腫瘤已超過心腦血管類疾病成為首位人類致

2、死性疾病, 采用Vero 細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的重組溶瘤性型單純皰疹病毒(HSV- )具有良好的溶源性、靶向性和安全性, 具有重要的應(yīng)用價值。國內(nèi)人類腫瘤疫苗的有關(guān)研究處于剛起步狀態(tài)，面臨多重難題，建立高效的腫瘤疫苗生產(chǎn)工藝具有非常重要的社會和經(jīng)濟價值。經(jīng)過重組減毒的型溶瘤單純皰疹病毒作為高效新型病毒疫苗有望用于腫瘤的臨床研究。1. 溶瘤病毒的作用機制生產(chǎn)材料：細胞培養(yǎng)：Vero 細胞HSV II，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。病毒株：重組型溶瘤單純皰疹病毒微載體：Cytodex 1生物反應(yīng)器2. 產(chǎn)品外觀圖3. Cytodex 1 微載體4.Vero 細胞圖 5.生物反應(yīng)器經(jīng)濟效益：；病毒株需向

3、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所申經(jīng)查閱 ATCC ， Vero 細胞為免費（不包郵）請?zhí)峁◣缀趺赓M）；微載體Cytodex 1 市價為 3 元 /瓶；生物反應(yīng)器可租借。成本保守估計（不算設(shè)備使用費）：每支成本約為6 元，預(yù)售價為98 元，除去設(shè)備費和人工生產(chǎn)費，約可凈得利潤30RMB/ 支（ 1ml） 。生產(chǎn)工藝流程：6. 生產(chǎn)車間流程圖在反應(yīng)罐培養(yǎng)間中進行重組HSV 病毒疫苗的微載體懸浮培養(yǎng)，步驟如下：Cytodex 1 微載體制備：稱取一定量Cytodex l 置于二甲基二氯硅烷硅化的轉(zhuǎn)瓶瓶子內(nèi)，加入PBS（pH 7 2）水化，比例約為80 150 mL g Cytodex 1 ，約 3h 后

4、將PBS 傾去， 加入新 PBS 繼續(xù)水化約3 h（可過夜）， 傾去并用新的PBS 洗滌一次。高壓滅菌 121， 30min ，冷卻后傾去PBS ，用培養(yǎng)基洗滌一次后傾去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置4冰箱平衡過夜，待用。PBS 繼續(xù)水化約3 h（可過夜 ），傾去并用新的 PBS 洗滌一次。高壓滅菌121， 30 min ，冷卻后傾去PBS ，用培養(yǎng)基洗滌一次后傾去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置4C 冰箱平衡過夜，待用。Vero 細胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)：Cytodex 1 濃度為 3 g L，接種密度2O 30 cells MC，轉(zhuǎn)速 45 r min，溫度 37C ，溶解氧濃度（DO）通過Air， O 和 N

5、：的進氣比控制在40空氣飽和度，pH 通過調(diào)節(jié)CO 的進氣量和7 5 （w v）NaHCO 控制在 7 15 7 2，進行1 5 L 5L 反應(yīng)器培養(yǎng)。Vero 細胞的微載體球轉(zhuǎn)球轉(zhuǎn)移培養(yǎng)：Vero 細胞于轉(zhuǎn)瓶反應(yīng)器內(nèi)微載體上培養(yǎng)24d，待長成單層時，向培養(yǎng)基中加入一定體積的新微載體，與長滿細胞的老微載體按照一定比例混合，進行間歇連續(xù)攪拌培養(yǎng)，待細胞轉(zhuǎn)移貼附成功后，進行常規(guī)連續(xù)攪拌培養(yǎng)。Vero 細胞的微載體在位消化轉(zhuǎn)移培養(yǎng)：Vero 細胞于轉(zhuǎn)瓶反應(yīng)器內(nèi)微載體上培養(yǎng)2 4d ，待細胞長成單層，即處于指數(shù)生長期時，進行在位消化轉(zhuǎn)移培養(yǎng)。首先停止攪拌， 待微載體沉降完全后將培養(yǎng)基排出，用 37C

6、溫浴的 PBS 以約 150 ml PBS g MC 的體積洗滌兩次。向微載體內(nèi)加入37C 溫浴的胰蛋白酶（含 0 02（WV）EDTA 50 ml g MC） 緩慢攪拌約2 min 后傾去胰酶液，靜止待細胞變圓后，以一定的比例加入含新微載體的培養(yǎng)基，并以一定轉(zhuǎn)速快速攪拌約2 min 后，補足培養(yǎng)基并以35 40 r min 的初始攪拌轉(zhuǎn)速連續(xù)攪拌培養(yǎng)。約培養(yǎng) 12 h 待細胞在微載體上完全貼附后，將微載體懸液放大到下一級生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)。重組 HSV- 病毒的反應(yīng)器培養(yǎng)：Vero 細胞于反應(yīng)器內(nèi)微載體上培養(yǎng)2 4d， 待細胞生長至 80 90 匯合時，接種病毒。接毒時將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)基排出

7、并用PBS洗滌 2 次，加入含BSA 的無血清病毒維持液（VD LSM） ，同時將培養(yǎng)溫度由37C降為 32進行病毒培養(yǎng)。待細胞病變至80 90后，將培養(yǎng)液進行4C 鹽裂解，收獲病毒。根據(jù)計數(shù)結(jié)果用Reed Munch 公式計算TCID50 。待細胞病變后收獲病毒。5高效構(gòu)建技術(shù)路線：利用病毒活性增效劑（輔助因子）與重組HSV 病毒疫苗共同左右增強產(chǎn)品效力。具體方案如下：首先選擇幾種能夠增強病毒活性的增效劑M1,M2,M3,M4 ，設(shè)計實驗選出能夠有效增強該溶瘤病毒的增效劑。設(shè)置5 個相同的培養(yǎng)基（合適的PH ，溫度 和 滲 透 壓 ） 放 入 等 量 腫 瘤 細 胞 作 為 唯 一 營 養(yǎng)

8、物 質(zhì) ， 1-4 號 分 別 加 入 相 同 劑 量 的M1,M2,M3,M4 增效劑，5 號加入等量生理鹽水作為對照。放在適宜的環(huán)境下培養(yǎng)一定時間后分別對5 個培養(yǎng)基中的腫瘤活細胞進行計數(shù)，統(tǒng)計并腫瘤活細胞最少的那一組，可以初步得出最佳增效劑。后期反復(fù)實驗已確定前面結(jié)果的正確，最后選出最佳增效劑并適量加入到溶瘤病毒疫苗中，確認(rèn)其安全性后投入到臨床應(yīng)用。6產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)格：本品為注射劑，1ml/支 .每 1 次人用劑量為1ml，病毒滴度=6.00 lgTCID50 ml;重金屬：含重金屬不得超過百萬分之十接種部位：手臂三角肌肌肉。無菌檢査：依法檢査（通則1101） ，應(yīng)符合規(guī)定;重組病毒

9、疫苗的GMP 標(biāo)準(zhǔn) :（ i ）在工作場所，保護工人遠離生物制劑暴露的風(fēng)險；操作規(guī)范，正確謹(jǐn)慎處理轉(zhuǎn)基因釋放的（微） 生物體或生物體含有重組DNA分子；保證人或獸用生物制品和藥品的安全性，vero 細胞來源的安全性等。7.參考文獻：1Montagnon B ， Fanget B ， Nicolas A The large scale cultivation ofVERO cellsin micro-carrier culture for virus vaccine production Preliminary results for killed poliovirus vaccine Deve

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