(精)現(xiàn)代中藥分析實(shí)驗(yàn)講義

1、現(xiàn)代中藥分析實(shí)驗(yàn)講義中藥學(xué)院分析化學(xué)教研室編X年4月 5日所屬課程現(xiàn)代中藥分析 核心課程學(xué)時(shí)36適用專業(yè)中藥學(xué) 1004 中藥制藥 1005課程英文名稱Analysis of Chinese Medicinal Preparation Experiment一、實(shí)驗(yàn)課程簡(jiǎn)介中藥制劑分析是一門以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代分析理論和方法研究中藥制劑質(zhì)量的綜合應(yīng)用性學(xué)科，是中藥專業(yè)的核心主干課程之一。二、實(shí)驗(yàn)課程目標(biāo)通過實(shí)驗(yàn)，加深對(duì)中藥制劑分析基本理論、基本知識(shí)的理解，正確、熟練地 掌握中藥制劑分析常用的法定方法及規(guī)范化的操作技能?，F(xiàn)代中藥分析實(shí)驗(yàn)是化學(xué)分析、 儀器分析、中藥學(xué)、方劑學(xué)、中藥炮制、中藥

2、鑒定學(xué)、中藥化學(xué)和中藥制劑學(xué)等相結(jié)合的一門具有很強(qiáng)實(shí)踐性和綜合性的應(yīng)用科學(xué)。本課程實(shí)踐教學(xué)既注重基本技能訓(xùn)練、又加強(qiáng)創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。在實(shí)踐教學(xué)內(nèi)容的安排上，既有驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生掌握藥 物分析的一般方法與技術(shù)特點(diǎn)；又有綜合性試驗(yàn)，使學(xué)生將理論知識(shí)和具體的藥 物分析測(cè)定技術(shù)融會(huì)貫通，掌握解決實(shí)際藥物分析技術(shù)問題的方法；還包括設(shè)計(jì) 性試驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生的研究創(chuàng)新能力。驗(yàn)證性、綜合性和設(shè)計(jì)性試驗(yàn)分步驟逐步實(shí) 施，使學(xué)生的理論和實(shí)驗(yàn)技能得到不斷的進(jìn)步。三、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（一）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一：加味香連丸的TLC 鑒別1 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)：6 學(xué)時(shí)2 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型：驗(yàn)證性、綜合性實(shí)驗(yàn)。3 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)?nèi)容：1加味香連丸中

3、黃連總堿的提??；黃連藥味的薄層鑒別。加味香連丸中揮發(fā)油的提?。凰幬兜谋予b別。4、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)習(xí)要求：（從運(yùn)用知識(shí)、提高能力兩個(gè)層次說明學(xué)習(xí)要求）（1） 運(yùn)用知識(shí)：中藥材及其復(fù)方制劑的TLC 鑒別、中藥有效部位的提取、對(duì)照液、供試液制備。 TLC 基本操作技能練習(xí)。（2） 提高能力：掌握中藥提取、凈化操作；5 種 TLC 溶液配制操作；TLC 規(guī)范操作；鑒別中藥真?zhèn)尾僮骷寄?。提高TLC 法鑒別中藥的能力及有效部位提取能力。、主要儀器設(shè)備與材料：千分之一天平、恒溫水浴鍋、層析缸、三用紫外分析儀、噴霧瓶、吹風(fēng)機(jī)、加味香連丸、鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃連及木香對(duì)照藥材，95%乙醇（ AR）。6 、與理論課程

4、的關(guān)系 ：本實(shí)驗(yàn)是在第二章鑒別基礎(chǔ)知識(shí)教學(xué)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。是中藥鑒別主要方法的直接應(yīng)用。是中國(guó)藥典的最主要方法。、實(shí)驗(yàn)步驟1） 取本品 60mg，研細(xì)，加乙醇 5ml，置水浴中加熱回流15 分鐘，濾過，濾液補(bǔ)加乙醇使成5ml，作為供試品溶液。另取黃連對(duì)照藥材50mg，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加乙醇制成每1ml 含 0.04mg 的溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2微升，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯：氯仿：甲醇：氨水：二乙胺（8：2： 2：1： 0.5 ）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位

5、置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個(gè)黃色熒光斑點(diǎn)。2） 取本品0.5g ，研細(xì)，加乙醚5ml ，放置 2 小時(shí)，時(shí)時(shí)振搖，濾過，濾液揮去乙醚，殘?jiān)哟姿嵋阴?.5ml 使溶解，作為供試品溶液。另取木香對(duì)照藥材0.2g ，加乙醚 5ml，同法制成對(duì)照藥材溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 微升，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷：丙酮（10： 3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在 105 烘約 5 分鐘。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色至藍(lán)紫色斑點(diǎn)。8 、數(shù)據(jù)處理： 給出鑒定結(jié)論如實(shí)記錄 , 畫出薄層板

6、( 黃連及木香 )、思考題：1） 定性鑒別需配置哪幾種溶液？為什么？2） 定性鑒別對(duì)量有哪些要求？（二）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目二： 紫外分光光度法測(cè)定加味香連丸中黃連生物堿的含量1 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)：6 學(xué)時(shí)2 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型：驗(yàn)證性、綜合性實(shí)驗(yàn)。3、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)?nèi)容： 1利用氧化鋁色譜柱凈化加味香連丸中黃連生物堿2利用紫外紫外分光光度法測(cè)定黃連總生物堿含量4、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)習(xí)要求： （從運(yùn)用知識(shí)、提高能力兩個(gè)層次說明學(xué)習(xí)要求）（1） 運(yùn)用知識(shí)：掌握用柱層析凈化提取物的方法；掌握紫外分光光度法測(cè)定復(fù)方中某一類物質(zhì)的方法。（2） 提高能力：掌握中藥提取、凈化操作；UV-VIS 規(guī)范操作；提高UV-VIS法測(cè)定中藥成分含

7、量的能力。、主要儀器設(shè)備與材料：1紫外 -可見分光光度計(jì)3中性 Al 2O3（150 200 目）2小層析柱：高13 cm，內(nèi)徑4樣品：加味香連丸8 mm，2 個(gè)對(duì)照品：鹽酸小檗堿6 、與理論課程的關(guān)系 ：本實(shí)驗(yàn)是在第四單元含量測(cè)定基礎(chǔ)知識(shí)教學(xué)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。是UV-VIS 法測(cè)定中藥成分含量方法的直接應(yīng)用。是中國(guó)藥典的主要方法。7 、實(shí)驗(yàn)步驟1 ）含量測(cè)定：A、樣品溶液配制：取加味香連丸0.5g ，研成細(xì)粉，精密稱取0.1g( 實(shí)驗(yàn)中稱取多少寫多少) ，置 60ml 索氏提取器中加 95%乙醇 40ml 連續(xù)回流提取生物堿至無(wú)色 。將提取液濃縮至20ml，定量轉(zhuǎn)移到 25ml容量瓶中，用9

8、5%乙醇至刻度 .精密吸取樣品液1.0ml 通過 Al2O 柱, 用 95%EtOH至洗脫完全，收集洗脫液于 10ml 容量瓶中，3連續(xù)加 95%乙醇至刻度，于 max350nm處測(cè)定吸收度。B、對(duì)照品溶液配制用 95%乙醇溶液，配制對(duì)照品溶液濃度為0.006mg/ml 。C、含量測(cè)定應(yīng)用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定加味香連丸中總生物堿的含量。、數(shù)據(jù)處理計(jì)算出 100g 加味香連丸中含有鹽酸小檗堿多少克?、思考題1） 如何判斷生物堿已被提取完全？2） 以測(cè)定小檗堿為例，除此方法外還有什么測(cè)定復(fù)方中黃連生物堿的方法？3） 本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定樣品紫外吸收度時(shí)，以什么作為空白對(duì)照液？為什么？（三）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目三： 復(fù)方丹參

9、滴丸中龍腦的含量測(cè)定1 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)：6 學(xué)時(shí)2 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型：驗(yàn)證性、綜合性實(shí)驗(yàn)。3 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)?nèi)容：1色譜條件的選擇；實(shí)驗(yàn)用溶液的配制，包括內(nèi)標(biāo)溶液、對(duì)照溶液及樣品溶液的配制；利用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定復(fù)方丹參滴丸中龍腦的含量。4、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)習(xí)要求： （從運(yùn)用知識(shí)、提高能力兩個(gè)層次說明學(xué)習(xí)要求）（1） 運(yùn)用知識(shí)：掌握氣相色譜法測(cè)定中藥制劑中成分含量的方法和原理；熟悉氣相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定的操作過程。熟悉氣相色譜儀各種操作條件的選擇應(yīng)用。（2） 提高能力： GC的基本操作、儀器條件確定；提高運(yùn)用GC 進(jìn)行藥物含量測(cè)定的能力。、主要儀器設(shè)備與材料：.1安捷倫 -6820 氣相色譜儀（FID 檢測(cè)器）、

10、微量進(jìn)樣器；.2SPB-5 毛細(xì)管色譜柱（弱極性）.3水楊酸甲酯（內(nèi)標(biāo)） 、醋酸乙酯（AR ）4.龍腦對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）.5復(fù)方丹參滴丸（天士力有限公司生產(chǎn)）。6 、與理論課程的關(guān)系 ：本實(shí)驗(yàn)是在第四單元有關(guān)氣相色譜法教學(xué)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。是中藥含量測(cè)定重要方法的直接應(yīng)用。是中國(guó)藥典的主要方法。、操作步驟色譜條件采用 SPB-5 毛細(xì)管色譜柱（弱極性） ，柱長(zhǎng) 30m，內(nèi)徑 0.32mm，液膜厚度 0.25 m，分流進(jìn)樣 1 L（分流比 1:20 ）；柱溫：初始溫度 100，保持 1min，以 8 / min 升至 180，保持 1min；后進(jìn)樣口溫度為 220；前檢測(cè)器溫度為

11、300；載氣為2左右；N，柱前壓 100kPa250kPa； FID 檢測(cè)器。理論塔板數(shù)按龍腦峰計(jì)算不低于十萬(wàn)；S；對(duì)稱H 50kPa；空氣R1.5性因子 T=0.95 。2. 校正因子測(cè)定內(nèi)標(biāo)溶液配制取水楊酸甲酯125mg，置 25mL 量瓶中，加醋酸乙酯至刻度，制成每lmL 含5mg的內(nèi)標(biāo)溶液。對(duì)照溶液配制取龍腦對(duì)照品5mg，精密稱定， 置 10mL量瓶中， 加內(nèi)標(biāo)溶液至刻度， 搖勻，作為龍腦對(duì)照溶液。測(cè)定校正因子取龍腦對(duì)照液1L 注入氣相色譜儀，測(cè)定至少5 次，計(jì)算校正因子。3 測(cè)定法取合成冰片5mg，精密稱定，置10mL 量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液使冰片溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取 2L，注

12、入氣相色譜儀，測(cè)定。按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。、注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前，必須對(duì)氣相色譜儀整個(gè)氣路系統(tǒng)進(jìn)行檢漏。如有漏氣，及時(shí)處理。開機(jī)前先通氣，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，先降溫、關(guān)機(jī)，后關(guān)氣。由于樣品中揮發(fā)性成分較多，樣品干燥時(shí)，要注意方法和溫度。、思考題在建立一個(gè)中藥制劑的測(cè)定方法時(shí)，如何進(jìn)行方法學(xué)考察？研究和設(shè)計(jì)中藥制劑的分析方法時(shí)，應(yīng)根據(jù)哪幾方面內(nèi)容？（四）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目四： 中藥制劑中橙皮苷的含量測(cè)定1 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)：6 學(xué)時(shí)2 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型：驗(yàn)證性、綜合性實(shí)驗(yàn)。3 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)?nèi)容：1 HPLC儀器使用及基本操作；色譜條件的選擇；實(shí)驗(yàn)用溶液的配制，包括橙皮苷對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備；利用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量分析。4、

13、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)習(xí)要求： （從運(yùn)用知識(shí)、提高能力兩個(gè)層次說明學(xué)習(xí)要求）（1） 運(yùn)用知識(shí)： HPLC 的具體應(yīng)用。掌握高效液相色譜儀的的基本操作及定量方法；（2） 提高能力：提高HPLC的基礎(chǔ)操作能力、儀器條件選擇能力；提高運(yùn)用HPLC 進(jìn)行藥物定量分析能力。、主要儀器設(shè)備與材料：高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器）C18 反相色譜柱（ Hypersil ODS 5 m 4.6 mm 250 mm）；3微量進(jìn)樣器4一次性注射器5 0.45 m 微孔濾膜容量瓶 50、 250 ml移液管，洗耳球；具塞三角瓶（ 50 ml）；超聲波清洗器；天平；濾紙、培養(yǎng)皿；炮彈管。橙皮苷對(duì)照（中國(guó)藥品生物制品檢定所）陳皮（天津

14、市飲片廠）6 、與理論課程的關(guān)系：本實(shí)驗(yàn)是在第四單元有關(guān)高效液相色譜法教學(xué)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。 是中藥含量測(cè)定重要方法的直接應(yīng)用。是中國(guó)藥典的主要方法。7 、操作步驟1） 色譜條件：色譜柱：C18,250 4.6mm， 5m；流動(dòng)相：43%甲醇；柱溫：室溫；流速：1ml/min；檢測(cè)：UVD，波長(zhǎng)為270nm；進(jìn)樣量：10L。理論塔板數(shù)n 3000。2） 橙皮苷對(duì)照品溶液的制備及測(cè)定：取橙皮苷對(duì)照品 1.6mg，加甲醇置 100ml 容量瓶中，制成 0.016mg/ml 的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取 10L 按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定對(duì)照品峰面積。3） 供試品溶液的制備：取中藥復(fù)方，精密稱取

15、0.3g 置錐形瓶中，加入甲醇 50ml，加塞稱重，超聲提取 15 分鐘后繼續(xù)稱重并用甲醇補(bǔ)足減少的重量。用 0.45 m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。4） 測(cè)定精密吸取 10L 供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定供試品中橙皮苷峰面積。）計(jì)算外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算100 克中藥復(fù)方中含有橙皮苷的克數(shù)（%）。（五）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目五：HPLC綜合實(shí)驗(yàn)一清顆粒測(cè)定1 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)：6 學(xué)時(shí)2 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型：綜合性實(shí)驗(yàn)。3 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)?nèi)容：1實(shí)際運(yùn)用HPLC 儀器，解決實(shí)際問題一清顆粒中黃芩苷的含量測(cè)定4、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)習(xí)要求： （從運(yùn)用知識(shí)、提高能力兩個(gè)層次說明學(xué)習(xí)要求）（1）運(yùn)用知識(shí)：現(xiàn)代中藥分析的特點(diǎn)

16、以及一般程序，掌握中藥分析方法學(xué)考察的基本內(nèi)容。（2）提高能力：提高運(yùn)用HPLC進(jìn)行藥物定量分析能力。、主要儀器設(shè)備與材料：高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器）C18 反相色譜柱（ Hypersil ODS 5 m 4.6 mm 250 mm）；3微量進(jìn)樣器4一次性注射器5 0.45 m 微孔濾膜容量瓶 50、 250 ml移液管，洗耳球；具塞三角瓶（ 50 ml）；超聲波清洗器；天平；濾紙、培養(yǎng)皿；炮彈管。對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）一清顆粒（自制）6 、與理論課程的關(guān)系：本實(shí)驗(yàn)是在第四單元有關(guān)高效液相色譜法教學(xué)基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。是中藥含量測(cè)定重要方法的直接應(yīng)用。是中國(guó)藥典的主要方法。、實(shí)驗(yàn)步驟

17、1 ）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱： Hypersil ODS （4.6 250 mm，5 m）流動(dòng)相：甲醇 -1%冰醋酸水溶液（ 52:48 ，v/v ）或（ 54:46 ，v/v ） 檢測(cè)波長(zhǎng)： 280 nm流速： 1 ml/min柱溫：室溫進(jìn)樣量： 5 l按黃芩苷計(jì)算理論塔板數(shù)不低于30002 ） 黃芩苷對(duì)照品溶液的制備精密稱取在105干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品適量，用g/ml 的黃芩苷對(duì)照品溶液，于4 C 保存，備用。75%乙醇配制成濃度為20.53 ）供試品溶液的制備取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加70%乙醇 10 ml ，超聲處理20

18、分鐘，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，上清液用0.45 m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。4 ）陰性溶液的制備取不含黃芩的藥材粉末照供試品溶液同法制備。5 ）測(cè)定法分別吸取陰性溶液、對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 L 注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品每袋（ 7.5 g ）含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計(jì)不得少于30.0 mg 。8 、黃芩苷含量測(cè)定的方法學(xué)考察8.1線性關(guān)系考察本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)一點(diǎn)法，不做線性考察。8.2精密度試驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液5 l 注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察儀器精密度。Table 8.1The results of precision test測(cè)定次數(shù)保留時(shí)間（

19、t R）峰面積（A）峰面積平均值RSD1234568.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)的一清顆粒供試品，按照3.3 項(xiàng)下供試品溶液的配制方法，平行制備6份供試品溶液，各取5 l ，注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣分析，考察方法的精密度。Table 8.2The results of reproducibility test of Baicalin樣品號(hào)W稱重峰面積黃芩苷含量含量平均值RSD1234568.4專屬性試驗(yàn)陰性溶液進(jìn)樣分析，與對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖對(duì)比，考察方法專屬性。8.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別于樣品制備后0 、 2、 4、 6、 12 及 24 h進(jìn)樣分析（依試驗(yàn)時(shí)間而定），考察

20、方法穩(wěn)定性。8.6加樣回收試驗(yàn)精密稱取已知含量的供試品6 份（依試驗(yàn)時(shí)間而定），按黃芩苷已知量的1 倍加入對(duì)照品，與 3.3 項(xiàng)同法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。（依試驗(yàn)時(shí)間而定）、一清顆粒中黃芩苷的含量測(cè)定（可用重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果）取同一批號(hào)的一清顆粒供試品，按照 3 ）項(xiàng)下供試品溶液的配制方法，平行制備3份以上樣品，計(jì)算每袋（7.5 g）中黃芩苷的含量（ mg）。（本次試驗(yàn)使用重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算一清顆粒中黃芩苷的含量）含量測(cè)定結(jié)果計(jì)算公式：CX = C R*AX*D*7.5*/(AR*W稱重 *1000)CX： mg/ 袋（ 7.5 g）CR：對(duì)照品溶液濃度（ g/ml ） AR：對(duì)照品溶液黃芩苷峰面積AX：供試品溶液黃芩苷峰面積D：供試品溶液體積（本次試驗(yàn)為50 ml ）W 稱 重 ：供試品實(shí)際稱重量（六）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目六：HPLC綜合實(shí)驗(yàn)一清顆粒測(cè)定1 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)時(shí)：6 學(xué)時(shí)2 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目類型：綜合性實(shí)驗(yàn)。3 、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)?nèi)容：1實(shí)際運(yùn)用HPLC 儀器，解決實(shí)際問題一清顆粒中黃芩苷的含量測(cè)定4、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目學(xué)習(xí)要求： （從運(yùn)