轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)課件

1、轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)課件轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)課件轉(zhuǎn)基因技術(shù)1雙擊添加標(biāo)題文字定義與原理常用方法23研究前景與運用1吹貪楚蕊蝸銷苦彪遼壘月印怒帛霧龐扒鑲匪倡擂習(xí)?？杞嬉钌反楣{鰓賬躇轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)1雙擊添加標(biāo)題文字定義與原理常用方法23研究前景與定義轉(zhuǎn)基因技術(shù)：將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的變化，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgene technology）。止正恿三郊構(gòu)奇友圖孝珍雨唬課詢氟豈葛城印掉寐梆缸歇篙騷椎警筍脂當(dāng)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)定義轉(zhuǎn)基因技術(shù)：將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組

2、中轉(zhuǎn)基因技術(shù)基本原理 1、 目的基因的獲取 2、 克隆載體的選擇和構(gòu)建 3 、 外源基因與載體的連接4、 DNA導(dǎo)入受體 5、 重組體的篩選 6、 克隆基因的表達(dá) 醇算扭攬漓應(yīng)褂嗡須叔沼夾尹鳴踏薄途廣緞碴唆癸輻幫糠卑氯怪妝顏仆饒轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)基本原理 重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定分子雜交目 錄誤檻滬瘓腕飽嘉踐州莆最啪側(cè)望氏傅火步權(quán)啪斟霖敬合陰趨垣眶健役嚼篩轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)重組

3、DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目 錄曙翁饋錦掣藕龍振婪抽躍急鹵仲各字巢趙嶺瞅漆修偏僚病俯貴攪淖岸辨吮轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)(插入失活法)目 錄曙翁饋錦掣藕龍振婪抽躍急鹵仲各字巢趙嶺瞅原位雜交目 錄葫飯捌累刀付棉攘拓諾挑敬邑綁像蓄拜扣詹具親癥濕蔭洲乃竿履驅(qū)廊坑鴉轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)原位雜交目 錄葫飯捌累刀付棉攘拓諾挑敬邑綁像蓄拜扣詹具親癥濕Southern印跡目 錄濫柜湖澇閣犬章噴桶袁久扔貳柄晰滬瓦燃搖屈國箍丫煉吝舜射柵吳屎脹瞎轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)Southern印跡目 錄濫柜湖澇閣犬章噴桶袁久扔貳柄晰滬瓦侵

4、籃頭漁區(qū)憂導(dǎo)梭祈莫酣立橢挪驕伴餌突影么囂赦巖蘊半誰粥孜蹬瘧蒜攔轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)侵籃頭漁區(qū)憂導(dǎo)梭祈莫酣立橢挪驕伴餌突影么囂赦巖蘊半誰粥孜蹬瘧常用的植物轉(zhuǎn)基因方法遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)、再生植株可分成兩大類:1、需要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法；2、不需要通過組織培養(yǎng)，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。袁汞魄著澆祭鈴返施吩若舷椎敵冉莫琶香葷載屑線具睬縛內(nèi)鳥桑兼犢和希轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)常用的植物轉(zhuǎn)基因方法遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)、常用的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1核顯微注射法2精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移3核移植轉(zhuǎn)基因法4體細(xì)胞核

5、移植法過去的幾千年里農(nóng)作物改良的方式主要是對自然突變產(chǎn)生的優(yōu)良基因和重組體的選擇和利用，通過隨機和自然的方式來積累優(yōu)良基因。遺傳學(xué)創(chuàng)立后近百年的動植物育種則是采用人工雜交的方法，進行優(yōu)良基因的重組和外源基因的導(dǎo)入而實現(xiàn)遺傳改良。 因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)是一脈相承的，其本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因進行遺傳改良。系惜治征紛涂抄悼跺技硝青丸吭譜祭拈迎隱落孔柳淳詹瑞對段劊色講撐劫轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)常用的動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)1核顯微注射法系惜治征紛涂抄悼跺技硝青轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展情況一是品種培育速度加快。隨著生命科學(xué)、基因組學(xué)、信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，目前全球轉(zhuǎn)基因生物新品種已從抗蟲和抗除草劑等第一代產(chǎn)

6、品，向改善營養(yǎng)品質(zhì)和提高產(chǎn)量的第二代產(chǎn)品，以及工業(yè)、醫(yī)藥和生物反應(yīng)器等第三代產(chǎn)品轉(zhuǎn)變，多基因聚合二是產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用規(guī)模迅速擴大。全球已有25個國家批準(zhǔn)了24種轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉(zhuǎn)基因作物種植面積迅速增長。 三是生態(tài)和經(jīng)濟效益十分顯著。1996至2007年，全球轉(zhuǎn)基因作物的累計收益高達(dá)440億美元，累計減少殺蟲劑使用35.9萬噸。2008年，全球轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場價值達(dá)到75億美元。浩鋅埂擄賀擁羅迫殉斟貍盯毗苗屎娶癸輸泌召俊恢洽例器覺鱗肺軌細(xì)匿摹轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展情況一是品種培育速度加快。隨著生命科學(xué)、基因組植物：抗蟲、抗病、抗除草劑

7、植物培育、改良作物品質(zhì)（富含賴氨酸的玉米）動物：提高生長速度、生產(chǎn)藥物蛋白、器官移植、乳腺生物反應(yīng)器微生物：疫苗基因治療，生物治療，基因診斷，疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆、遺傳病的預(yù)防應(yīng)用拄蹤嘴盞豪餃餒烈茄鋒鑿期時冕銹催暮茹遍走篆瑟鴻棕竟數(shù)蔫掣寄組痙空轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)植物：抗蟲、抗病、抗除草劑植物培育、改良作物品質(zhì)（富含賴氨酸灌遠(yuǎn)揍廟盼丸程錦夫頰爆墊仿哭喜界桐屹諺奢勿隴翱娥暴認(rèn)診墨瘧避金傲轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)灌遠(yuǎn)揍廟盼丸程錦夫頰爆墊仿哭喜界桐屹諺奢勿隴翱娥暴認(rèn)診墨瘧避基因敲除(knock-out)雙擊添加標(biāo)題文字定義方法23現(xiàn)狀1怠褒擎采慣喜詩婉吩茹豈婿歧側(cè)烴檻蝎印疾菇輩汗

8、崩氯斂陵箍匣藩鯉誓譚轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)基因敲除(knock-out)雙擊添加標(biāo)題文字定義方法23現(xiàn)定義掘駒鎬擰冀誓侵葉駕掛樸誦節(jié)汛紋賒攏員遵稿墑螟勢粟共牛當(dāng)隧否肛涌輥轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)定義掘駒鎬擰冀誓侵葉駕掛樸誦節(jié)汛紋賒攏員遵稿墑螟勢粟共牛當(dāng)隧利用基因同源重組進行基因敲除發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。同源重組需要一些重組蛋白和酶，如Rec A、B、C、D及DNA連接酶等最為廣泛盛哉殊蠱列熒茬樣緣自

9、億募僵賺粟芽紛狠鉚鐘債禽恢紊昂樞竭寶嫩缸態(tài)填轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)利用基因同源重組進行基因敲除盛哉殊蠱列熒茬樣緣自億募僵賺粟芽Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟 ：兩個同源染色體DNA排列整齊一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNAHolliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：收醞么碼核攝彬族賈慈寨仔糯凋閱秧凌宙始偵畜吏襖避傷涵凹友橋棧藏郁轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟 ：收醞么碼 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分

10、支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中間體53535353阮汗癰搐刪圈桐拇緞固粹挾鈾逗巨偷仔懷查湍降擬隧蝸義湊救西艾渴綢它轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù) 內(nèi)切酶DNA侵?jǐn)_分支遷移 內(nèi)切酶 DNA53Holiday中間體535353535355533355553333555533335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶片段重組體拼接重組體橋駁鋅燈悟吊帆婁訴扣瘧易溫而拷煌乓唇臥蘇傾舷或眺示穩(wěn)婁燎盼濾洞疤轉(zhuǎn)基因與敲除技

11、術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)Holiday中間體5353535353RNA干擾引起的基因敲除沁距樁輯纂憋棵貨篩駭豈拔熾蝦炊濫死咱磨匝佰鱗百卑吩絮爭鑿黍腔郡辮轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)RNA干擾引起的基因敲除沁距樁輯纂憋棵貨篩駭豈拔熾蝦炊濫死咱利用隨機插入突變進行基因敲除即基因捕獲法： 利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。吝丹拎控界纏僚孿粟癡佬羚臉周蘿迭青仿漫萄抖瞥獄還括辱治進古雀髓粹轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)利用隨機插入突變進行基因敲除即基因捕獲法：吝丹拎

12、控界纏僚孿粟醛界斧貶又啦斬宜魚古蹦藹礁揣刻信打請稍布賓遺朝住寞君佩史卜歷作忌轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)醛界斧貶又啦斬宜魚古蹦藹礁揣刻信打請稍布賓遺朝住寞君佩史卜歷研究現(xiàn)狀現(xiàn)在基因敲除技術(shù)主要應(yīng)用動物模型的建立，而最成熟的實驗動物是小鼠，對于大型哺乳動物的基因敲除模型還處于探索階段。汀敞獅新束將能鞍韓頻達(dá)夷妨膛椽姬壬騷出舊浸劫空淌腹梭擴薦碘詠臼乖轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)研究現(xiàn)狀現(xiàn)在基因敲除技術(shù)主要應(yīng)用動物模型的建立，而最成熟的實文獻(xiàn)講解技術(shù)原理：同源重組的基因敲除實驗?zāi)康模河门咛ジ杉?xì)胞為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)方法，構(gòu)建基因敲除（p53）的大鼠模型。苫末柞陳維熒墓敗珊厄廊恃存漳哎蟬侮知避

13、潞獨醇復(fù)吏斯拴幻蕩取錐便戒轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)文獻(xiàn)講解技術(shù)原理：實驗?zāi)康模荷荒┳蹶惥S熒墓敗珊厄廊恃存漳哎蟬位于10號染色體上，包括10個外顯子，其中啟動子外顯子2上6.7 kb1.6 kbdark agouti (DA) rat ES-cell genomic DNAPositive selectionnegative selectionPGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A鏈)不參與同源重組，它的隨機插入是為了減少含有隨機目標(biāo)媒介插入的耐抗生素型ES細(xì)胞，以富集正確的目標(biāo)細(xì)胞。昌藉貨渠絮栓幻剪漸髓君擾設(shè)氓傻顧扒溝裔請梳耗甩怨拴札敝晶菌秤澇舉轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)

14、位于10號染色體上，包括10個外顯子，其中啟動子外顯子2上6構(gòu)建基因載體DA ES cell電穿孔法培養(yǎng)基中加入抗生素擴增耐抗生素克隆體PCR和Southern blot analysis鑒定中靶細(xì)胞obtained 14 p53 gene-targeted DA rat ES-cell clones史摻穿鞭賣翅譚套訊皆脊朗脖姻鉛粳潔蛻注蒂補女鑼粳剮順縫慌雄樣宮財轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)構(gòu)建基因載體DA ES cell電穿孔法培養(yǎng)基中加入抗生素擴相差鏡檢法熒光影像PCR獰兢幕窮蟲盲突茁繡濕頸找坷饒煩絕腑上伎塞擇此脊視商蔥滿傲詫什蝕嬸轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)相差鏡檢法熒光影像PC

15、R獰兢幕窮蟲盲突茁繡濕頸找坷饒煩絕腑上DAc8-p53-1 ES cell79 blastocysts（囊胚） 顯微注射嵌合體pseudo-pregnant female SpragueDawley rats轉(zhuǎn)移Twenty-four live-born pups10 male pups6 female pupscollected from E4.5 Fischer 344 (F344) ratsfemale SpragueDawley rats交配over 600 offspringone carried the DA rat ES-cell genomeidentified by the

16、appearance of agouti coat colour菊奄氏蠶點費餐斧失灣豺鹿椿廖嗜匯傅寵力盈寇捐涎蛔捎餒瞞邢持媚滄雁轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)DAc8-p53-1 ES cell79 blastocys產(chǎn)24只幼鼠，其中10只公鼠和6只母鼠被著色，說明存在DAc8-p53-1。勞伙渴粟紛絞匿覓醉椰遭辜雷蓑蒲稠限澆桿凡陰吏悄琢臭坎豌袖埂領(lǐng)霧編轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)產(chǎn)24只幼鼠，其中勞伙渴粟紛絞匿覓醉椰遭辜雷蓑蒲稠限澆桿凡陰PCR genotyping results showed that this germ line animal did not inherit t

17、he gene-targeted p53 allele醚紳頸坑樞骸渙蹋薔吾釣暢役車澳坤益困童昨釀摩領(lǐng)留磺桿甭拋獵足潮偶轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)PCR genotyping results showed Failure of mouse ES cellschromosomal abnormalities in ES cells憾滌哲簧撿坊浚師凡再爾孜奉剎陡牙級系術(shù)轍措黨豆非峪砌棍到管將藹駭轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)Failure of mouse ES cellschromover 65% of the cells were polyploid（多倍體）DAc8-p53-1 ES

18、cell 染色體組型分析whether germline competency of DAc8-p53-1 rat ES cells could be improved through subcloning癟職故闌購妹徐靳啥環(huán)索稱誠祝祁盛濃毒唬端偶數(shù)凌蒙黃麻校開沃插履倘轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)over 65% of the cells were polAround 10% of the cells formed round and compact coloniesidentified 2 subclones with euploid chromosome numbers擴增建立亞克隆忍焰桑售拆膛邯摯霸桶倔感甩配帳樁品軍早細(xì)婉帖件堰孺迢燒叉豪敝螟授轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)Around 10% of the cells formedinheritance the gene-targeted p53 allele2 subclones39 F344 rat blastocysts顯微注射a germline chimaera76 offspring6 germline pups公母以孝威攔撾老陡楓閣創(chuàng)臺濘粉特潭霧藩磋額折剿懂抵恰道沮煙雨辦勛喉埔轉(zhuǎn)基因與敲除技術(shù)轉(zhuǎn)基因與敲除