蒙藥三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS快速分析與鑒定

1、PAGE 8 -蒙藥三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS快速分析與鑒定李君胡玉霞張夢(mèng)迪王躍武張謙胡格吉胡高峰常福厚關(guān)鍵詞蒙藥;三子散;高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜;成分組成;結(jié)構(gòu)鑒定三子散系蒙古族經(jīng)典名方，收載于2022年版中國(guó)藥典（一部），由訶子、川楝子、梔子3味藥材按111配比組成1。該方具有清血熱、解毒等功效，將其制成糊狀外用還具有收斂、止痛、消炎的作用，蒙醫(yī)臨床用于溫?zé)?、血熱、眩暈、新久熱等疾病的治??，F(xiàn)有研究表明，三子散所含化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類、鞣質(zhì)類、黃酮類、有機(jī)酸類等3，但其在疾病治療過(guò)程中發(fā)揮藥效的活性成分尚不清楚。而明確該方的化

2、學(xué)物質(zhì)組成是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要前提。本課題組前期采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，以方中沒(méi)食子酸、阿魏酸、梔子苷、槲皮素、川楝素等10種成分含量為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)三子散的醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)化4，并在最優(yōu)提取工藝的支撐下，通過(guò)冷凍干燥技術(shù)獲得了三子散醇提物。在此基礎(chǔ)上，本研究采用具有分析周期短、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)的高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-Q-Exactive-MS）技術(shù)對(duì)三子散醇提物中的復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行快速在線分離與鑒定，從而為后續(xù)該方移行入血成分分析、藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)相關(guān)性研究等提供基礎(chǔ)，進(jìn)而闡明該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。1材料1.1主要儀器HPLC-Q-

3、Exactive型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（含Ultimate3000型色譜儀、Q-Exactive型高分辨質(zhì)譜儀）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;AP135W型十萬(wàn)分之一電子天平購(gòu)自日本Shimadzu公司;KH-500DV型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山禾創(chuàng)超聲有限公司;2TB-A型磁力加熱攪拌電熱套購(gòu)自山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;RE3000A型全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司;FDU2110型冷凍干燥機(jī)購(gòu)自東京理化器械株式會(huì)社。1.2主要藥品與試劑梔子（批號(hào)19072703，產(chǎn)地為江西）、川楝子（批號(hào)202202231，產(chǎn)地為四川）、訶子（批號(hào)20222403，產(chǎn)地為

4、云南）飲片均購(gòu)自內(nèi)蒙古北域藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室渠弼教授鑒定分別為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis、楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.和絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.vartomentellaKurt.的干燥成熟果實(shí)。川楝素（批號(hào)111824-202204，純度96.9%）、梔子苷（批號(hào)110749-202218，純度97.6%）、山柰酚（批號(hào)110861-202213，純度98.0%）、沒(méi)食子酸（批號(hào)110831-202205，純度98.8%）、鞣花酸（批號(hào)111959-2022

5、03，純度88.8%）、槲皮素（批號(hào)100081-202210，純度99.1%）、阿魏酸（批號(hào)110773-202214，純度99.0%）、蘆?。ㄅ?hào)21020402，純度98.0%）、綠原酸（批號(hào)110753-202218，純度96.1%）9種對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;柯里拉京（批號(hào)DST190113-012，純度98.2%）、木犀草素（批號(hào)DSTDM003201，純度98.0%）、齊墩果酸（批號(hào)DSTDQ005101，純度98.0%）3種對(duì)照品均購(gòu)自成都德思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、乙酸銨均為分析純，水為超純水。2方法2.1色譜-質(zhì)譜條件采用Shim-pac

6、kGIST-HPC18色譜柱（150mm4.6mm，3m），以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（010min，10%A;1015min，10%A30%A;1525min，30%A70%A;2530min，70%A90%A;3035min，90%A;3540min，10%A）;流速為1mL/min;柱溫為40;進(jìn)樣量為10L。采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下檢測(cè)。正離子檢測(cè)模式下的檢測(cè)條件為：輔助氣體積流量30L/min，噴霧電壓3.50kV，離子傳輸管溫度300，輔助氣溫度200，碰撞能量45eV;負(fù)離子檢測(cè)模式下的檢測(cè)條件為：輔助氣體積流量30L/mi

7、n，噴霧電壓2.80kV，離子傳輸管溫度400，輔助氣溫度100，碰撞能量30eV。檢測(cè)方式為FullMS/dd-MS2，F(xiàn)ullMS分辨率為70000，dd-MS2分辨率為17500，掃描范圍為m/z1101200。2.2溶液的制備2.2.1供試品溶液的制備根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)4，按處方比例稱取川楝子、梔子、訶子飲片，粉碎，混勻，過(guò)60目篩。稱取混合粉末共約180.00g，置于圓底燒瓶中，加50%乙醇1800mL，用電熱套加熱回流提取3次、每次1.5h，分別過(guò)濾并收集濾液。合并3次濾液，旋蒸濃縮，回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，得到三子散醇提物凍干粉。稱取上述凍干粉1.0g于10mL量瓶中，加甲醇至刻

8、度后稱質(zhì)量，超聲（功率200W，頻率50kHz）20min，冷卻至室溫，再次稱定其質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，經(jīng)0.22m微孔濾膜濾過(guò)，即得。2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取川楝素、梔子苷、齊墩果酸、山柰酚、沒(méi)食子酸、鞣花酸、柯里拉京、槲皮素、阿魏酸、蘆丁、木犀草素、綠原酸12種對(duì)照品各適量，分別置于不同10mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成上述12種成分質(zhì)量濃度分別為475、201、258、285、206、200、239、237、255、228、292、344g/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，置于同一10mL量瓶中，加甲醇定容，制成上述12種成分質(zhì)量濃度分別

9、為950、402、516、570、412、400、478、474、510、456、584、688ng/mL的混合對(duì)照品溶液，將其置于4保存，備用。2.3數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及分析利用中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索有關(guān)三子散全方及各單味藥材化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)，將收集的化學(xué)成分信息進(jìn)行匯總，建立一個(gè)包括化合物名稱、分子式、精確分子量、一級(jí)和多級(jí)質(zhì)譜碎片等信息的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，從而為化合物的鑒定提供參考。將供試品溶液和對(duì)照品溶液在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)到的質(zhì)譜信息導(dǎo)入Xcalibur3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用HPLC-Q-Exactive-MS高分辨質(zhì)譜計(jì)算化合物的精確分子量，再結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜信息及Xcalib

10、ur3.0軟件擬合的分子式，通過(guò)與已建立數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物信息和部分對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，以實(shí)際測(cè)得與理論的偏差小于10ppm為原則5，快速鑒別出三子散醇提物中所含有的固有化學(xué)成分。3結(jié)果3.1三子散醇提物的總離子流圖及成分分析按“2.1”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件，對(duì)三子散醇提物進(jìn)行HPLC-Q-Exactive-MS檢測(cè)分析，獲得了三子散醇提物在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的總離子流圖（見(jiàn)圖1）。根據(jù)“2.3”項(xiàng)下分析方法，最終鑒定出化合物64個(gè)，包括9個(gè)黃酮類成分、13個(gè)環(huán)烯醚萜類成分、14個(gè)有機(jī)酸類成分、18個(gè)鞣質(zhì)類成分、3個(gè)三萜類成分、3個(gè)氨基酸類成分和4個(gè)脂肪酸類成分。其中，有11個(gè)成分的結(jié)構(gòu)通過(guò)與

11、對(duì)照品比對(duì)得到了確證。三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。3.2成分鑒定過(guò)程分析鑒于同類成分具有相似的裂解規(guī)律，本文選取組方中主要含有的環(huán)烯醚萜類成分、黃酮類成分、有機(jī)酸類成分和鞣質(zhì)類成分為例進(jìn)行成分鑒定過(guò)程分析。3.2.1環(huán)烯醚萜類成分在組方中共鑒定出環(huán)烯醚萜類化合物13個(gè)。本研究以梔子苷（化合物33）為例來(lái)說(shuō)明環(huán)烯醚萜類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z433.13382M+COOH-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰相繼脫去1分子甲酸和1分子中性碎片葡萄糖殘基后產(chǎn)生碎片離子峰m/z225.07703M-HGlu-，然后進(jìn)一步丟失1分子H2O得

12、到碎片離子峰m/z207.06587M-H-Glu-H2O-，隨后苷元進(jìn)一步發(fā)生逆狄爾斯-阿德?tīng)柗磻?yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z123.04395。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對(duì)照品比對(duì)結(jié)果5，7，確認(rèn)化合物33為梔子苷。梔子苷對(duì)照品和化合物33的二級(jí)質(zhì)譜（MS2）圖分別見(jiàn)圖2、圖3，梔子苷可能的裂解途徑見(jiàn)圖4。3.2.2黃酮類成分在組方中共鑒定出黃酮類化合物9個(gè)。本研究以蘆丁（化合物39）為例來(lái)說(shuō)明黃酮類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z609.14722M-H-的準(zhǔn)分子離子峰，并發(fā)現(xiàn)其主要二級(jí)碎片離子峰為m/z301.03476、m/z300.02780、m/z2

13、71.02527、m/z151.00262，即準(zhǔn)分子離子峰通過(guò)碰撞解離丟失蕓香糖產(chǎn)生碎片離子峰m/z301.03476M-HC12H20O9-，并進(jìn)一步脫去1個(gè)氫產(chǎn)生碎片離子峰m/z300.02780M-H-C12H20O9-H-，或脫去1個(gè)中性碎片H2CO產(chǎn)生碎片離子峰m/z271.02527M-H-C12H20O9-H2CO-，或發(fā)生逆狄爾斯-阿德?tīng)柗磻?yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z151.00262。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對(duì)照品比對(duì)結(jié)果，確認(rèn)化合物39為蘆丁11。蘆丁對(duì)照品和化合物39的MS2圖分別見(jiàn)圖5、圖6，蘆丁可能的裂解途徑見(jiàn)圖7。3.2.3有機(jī)酸類成分在組方中共鑒

14、定出有機(jī)酸類化合物14個(gè)。本研究以綠原酸（化合物28）為例來(lái)說(shuō)明有機(jī)酸類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z353.08774M-H-的準(zhǔn)分子離子峰，其特征裂解途徑為結(jié)構(gòu)中酯鍵斷裂產(chǎn)生奎寧酸（quinicacid，QA）及咖啡酸（caffeicacid，CA），主要二級(jí)碎片離子峰為m/z191.05554QA-H-、m/z179.03423CA-H-、m/z173.04475QA-H-H2O-、m/z135.04410CA-HCO2-，即準(zhǔn)分子離子峰脫去咖啡酰氧基或奎尼酸基團(tuán)產(chǎn)生m/z191.05554QA-H-或m/z179.03423CAH-的特征碎片離子峰，然后進(jìn)一步丟失1

15、分子CO2或1分子H2O產(chǎn)生m/z173.04475QA-H-H2O-、m/z135.04410CA-H-CO2-的碎片離子峰。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對(duì)照品的比對(duì)結(jié)果，確認(rèn)化合物28為綠原酸9-10。綠原酸對(duì)照品和化合物28的MS2圖分別見(jiàn)圖8、圖9，綠原酸可能的裂解途徑見(jiàn)圖10。3.2.4鞣質(zhì)類成分在組方中共鑒別出鞣質(zhì)類化合物18個(gè)。本研究以柯里拉京（化合物30）為例來(lái)說(shuō)明鞣質(zhì)類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z633.07440M-H-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰失去1分子沒(méi)食子酰葡萄糖單元形成特征碎片離子峰m/z300.99939M-H-galloyl-

16、glu-，或失去1分子葡萄糖單元和1分子六羥基二苯甲酰基（HHDP）產(chǎn)生碎片離子峰m/z169.01334M-H-glu-HHDP-。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對(duì)照品比對(duì)的結(jié)果，確認(rèn)化合物30為柯里拉京11?？吕锢?duì)照品和化合物30的MS2圖分別見(jiàn)圖11、圖12，柯里拉京可能的裂解途徑見(jiàn)圖13。4討論在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組對(duì)不同流動(dòng)相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸溶液）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入適量甲酸能夠明顯改變組方中成分的質(zhì)譜響應(yīng)值;而與甲醇比較，采用乙腈為流動(dòng)相組成部分能夠顯著提高組方中各成分的分離度。因此，本研究采用乙

17、腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相體系。由于傳統(tǒng)復(fù)方制劑中成分較多且響應(yīng)模式不盡相同，為獲得全面的質(zhì)譜信息，本研究采用正、負(fù)離子全掃描模式對(duì)三子散醇提物中的化學(xué)成分進(jìn)行了辨識(shí)分析。結(jié)果，在三子散醇提物中共鑒定出64個(gè)化學(xué)成分，以環(huán)烯醚萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸類為主?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，環(huán)烯醚萜類成分梔子苷在抗炎、抗氧化、降壓、調(diào)脂等方面作用顯著，并具有保肝利膽的作用17-18。黃酮類化合物存在于多種藥用植物中，具有多重生物活性：槲皮素可通過(guò)縮小心肌梗死面積、降低心肌髓過(guò)氧化物酶活力而發(fā)揮心肌保護(hù)作用19;蘆丁具有顯著的抗炎活性，且該作用可能與其減少促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)20。鞣質(zhì)類成分大多具有抗真菌及抗腫瘤活性，同時(shí)對(duì)結(jié)腸癌、肝癌和宮頸癌細(xì)胞均表現(xiàn)出了一定的抑制作用11。此外，本研究還鑒定出了多種有機(jī)酸類成分，其在心血管相關(guān)疾病方面作用廣泛：蘋果酸可提高琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶