生物酶工程市公開課獲獎?wù)n件

1、Ch6 生物酶工程生物酶工程（Biological Enzyme Engineering）： 是指在基因水平上，對酶蛋白分子進(jìn)行修飾、改造，改進(jìn)酶蛋白催化特性或酶蛋白蛋白質(zhì)特性等。本章主要簡介 核酶、進(jìn)化酶、雜合酶和抗體酶相關(guān)基本概念和基本知識。第1頁第1頁Ch6-1 核酶(Ribozyme)到當(dāng)前為止，除了我們傳統(tǒng)概念酶蛋白質(zhì)外，還發(fā)覺另一類含有催化活性物質(zhì)核酸。這里核酶要和核酸酶（Nuclease）概念區(qū)分開來，前者是酶化學(xué)本質(zhì)是核酸；后者是指催化核酸水解酶，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)；1981年Cech等發(fā)覺四膜蟲核糖體前體RNA能夠在沒有酶蛋白存在情況下，本身催化切除內(nèi)涵子，完成加工過程；發(fā)覺

2、了含有催化活性RNA，從而提出了核酶這個概念。因為核酶含有很多與酶蛋白截然不同特點，尤其在醫(yī)學(xué)界優(yōu)勢更為突出，用于基因治療能夠克服一直困擾人們免疫問題。因此近些年來引發(fā)了酶工程研究領(lǐng)域極大熱情。 到當(dāng)前為止，已經(jīng)發(fā)覺天然核酶作用底物都是核酸，按其催化反應(yīng)可分兩類：剪切型核酶：這類核酶主要催化本身或異體RNA切割，相稱于核酸內(nèi)切酶作用。當(dāng)前發(fā)覺剪切型核酶包括三種： 錘頭型核酶 R. Symons研究一些植物病毒RNA本身剪切功效后，提出了錘頭狀二級結(jié)構(gòu)模型； 發(fā)卡型核酶 發(fā)卡型核酶二級結(jié)構(gòu)象一個發(fā)卡裝，由50個堿基構(gòu)成，它和底物14個堿基共同構(gòu)成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)，辨認(rèn)順序是NGUC，在N-G之間切割

3、。 蛋白質(zhì)RNA 復(fù)合酶 由蛋白質(zhì)和M1RNA兩個部分構(gòu)成，其中蛋白質(zhì)分子量Da，RNA部分函377個堿基。催化活性完全有RNA部分完畢，蛋白質(zhì)部分只是維護(hù)RNA構(gòu)象，主要功效是剪切修飾tRNA。剪接型核酶：這類核酶主要催化mRNA前體修飾加工，切除內(nèi)含子，并完畢片段拼接； 主要包括組內(nèi)含子和組內(nèi)含子。Cech 研究發(fā)覺四膜蟲核糖體RNA前體，含有本身切除413 堿基intron，并進(jìn)行片段拼接功效，進(jìn)一步研究發(fā)覺，其Intron 本身含有催化RNA前體剪輯功效。脫氧核酶： 前述核酶化學(xué)本質(zhì)是RNA，在發(fā)覺RNA核酶后，不久就發(fā)覺了切割RNA和DNADNA核酶。1994年，Breaker 利用

4、體外選擇技術(shù)，初次發(fā)覺了切割RNADNA分子，命名為脫氧核酶（DNAzyme）關(guān)于核酶應(yīng)用前景關(guān)于核酶研究，主要目的是將其應(yīng)用于基因治療，總體上講，當(dāng)前處于研究階段。開發(fā)公司治療對象研究階段American CyanamidColumbia UniversityGene ShearsInnovirOsaka UniversityRibozyme Ph. Inc.Tokyo UniversityB細(xì)胞白血病-淋巴瘤人免疫缺點病毒人免疫缺點病毒乙肝病毒，丙肝病毒乙肝病毒，丙肝病毒丙肝病毒人免疫缺點病毒血管生長因子丙肝病毒臨床前期臨床前期一、二期臨床臨床前期臨床前期臨床前期一、二期臨床臨床前期臨床前

5、期關(guān)于核酶用于基因治療研究存在主要問題 體內(nèi)運(yùn)送與細(xì)胞吸取及殘留問題： 切割位點特異性選擇問題： 本身穩(wěn)定性問題： 毒性和免疫原性問題：第2頁第2頁Ch6-2 酶分子定向進(jìn)化（Directed Evilution）酶分子定向進(jìn)化是指在分子水平上，人為地創(chuàng)造特殊進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），對酶基因進(jìn)行改造，并進(jìn)行定向選擇，篩選出所需性質(zhì)酶蛋白。對酶蛋白分子改造，主要包括兩個方面，即酶分子改造合理化設(shè)計（Rational Design）和非合理設(shè)計（Irrational Design）合理化設(shè)計：主要指事先已經(jīng)弄清楚了酶蛋白結(jié)構(gòu)，有明確修飾目的，定點改造某一結(jié)構(gòu)活某

6、氨基酸而設(shè)計改造修飾方案，如酶蛋白化學(xué)修飾、酶蛋白基因定點突變等；非合理設(shè)計： 事先不必擬定基因改造修飾目的，設(shè)計酶蛋白基因改造技術(shù)和辦法，設(shè)計基因改造方案，然后按照預(yù)定目的要求，進(jìn)行篩選。酶分子定向進(jìn)化就屬于非合理設(shè)計。 1. 酶分子定向進(jìn)化辦法： 當(dāng)前已經(jīng)研究成功酶蛋白分子定向進(jìn)化辦法只要包括一下幾種方面： 易錯PCR辦法； DNA改組辦法； 基因家族之間同源重組辦法； 易錯PCR法：易錯PCR是在利用PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)在Taq聚合酶催化下，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過調(diào)整反應(yīng)條件（提升Mg 2濃度、加入Mn 2 改變反應(yīng)體系中四種dNTP百分比濃

7、度等） ，改變Taq酶催化目的基因擴(kuò)增中突變頻率，以一定頻率隨機(jī)構(gòu)件了基因突變庫，然后選擇或篩選符合需要突變體。易錯PCR關(guān)鍵在于一下兩點控制： 每個目的基因突變堿基數(shù)要嚴(yán)格控制：突變率不應(yīng)太高，太高時酶基因突變太大，酶固有活力不易保持，太低不易實現(xiàn)酶分子有效進(jìn)化，普通理論上講每個靶基因?qū)胪蛔儔A基數(shù)控制在1.55個； 普通一次突變很難取得有用突變，因此在設(shè)計易錯PCR時，是設(shè)計連續(xù)易錯PCR 擴(kuò)增，連續(xù)進(jìn)行隨機(jī)突變，從而取得符合進(jìn)化目的突變體。易錯PCR定向進(jìn)化應(yīng)用實例：利用易錯PCR定向進(jìn)化L天冬氨酸酶實例設(shè)計工作程序：易錯PCR篩選突變體（優(yōu)勢突變重組篩選）；研究結(jié)果： 取得了一株酶活力

8、提升28倍突變體；并且進(jìn)化酶pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于原始酶。進(jìn)一步測序研究表明進(jìn)化后突變體共發(fā)生了7個堿基突變，其中3個突變位點引起了氨基酸改變Asn217Lys； Thr233 Arg； Val367 Gly第3頁第3頁Ch6-2 酶分子定向進(jìn)化（Directed Evilution）DNA改組技術(shù)DNA改組技術(shù)是在易錯PCR辦法基礎(chǔ)上發(fā)展起來，設(shè)想通過易錯PCR取得兩個或兩個以上正突變突變體，假如將這些正突變突變部位整合到一個突變體上，會取得更為突出定向進(jìn)化效果。詳細(xì)辦法是將多個正突變突變體混合，然后用脫氧核糖核酸酶進(jìn)行隨機(jī)切割，得到隨機(jī)DNA片段，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此時隨機(jī)DNA

9、片段互為模版（Template）或引物（Primer），直到取得全長基因片段后，進(jìn)行分離和篩選，以取得高效突變體。基因家族之間同源重組本定向進(jìn)化辦法是利用自然界中天然存在基因家族出發(fā)，利用它們之間同源順序進(jìn)行重組，這種辦法取得高效突變幾率較大，并且盲目性小，容易取得抱負(fù)進(jìn)化效果。研究報道實例：Stemmer等利用來自4種微生物編碼頭孢菌素酶基因進(jìn)行同源重組進(jìn)化研究，取得了進(jìn)化重組體產(chǎn)酶活性提升了270倍。2.酶分子定向進(jìn)化酶工程意義酶分子定向進(jìn)化研究實踐表明， 在改造、修飾酶蛋白分子方面主要表達(dá)下列幾點： 提升酶分子催化活力 提升酶催化活力始終是酶工程研究最實際、最有價值研究熱點之一。關(guān)于定向

10、進(jìn)化提升酶催化活力實例前已列舉，這里提升酶催化活力和提升產(chǎn)酶菌株產(chǎn)酶活力概念要加以區(qū)別，酶分子定向進(jìn)化是通過對酶蛋白分子進(jìn)行改造來實現(xiàn)酶活力提升；但老式在酶工程研究領(lǐng)域，對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行誘變育種、哺育，實現(xiàn)產(chǎn)酶活力提升，后者不排除有造成酶蛋白分子發(fā)生改變也許，但更主要是通過點突變，改變細(xì)胞代謝調(diào)控機(jī)制而實現(xiàn)產(chǎn)酶活力提升。 改進(jìn)酶蛋白穩(wěn)定性：提升酶蛋白穩(wěn)定性，尤其是熱穩(wěn)定性提升，是酶工程研究另一研究熱點。由于在關(guān)于生產(chǎn)中，提升反應(yīng)溫度，能夠提升底物溶解度、減少反應(yīng)介質(zhì)黏度，提升酶催化活力，尤其是預(yù)防在生產(chǎn)過程中微生物污染。Zhao H 等在對枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行定向進(jìn)化研究中，取得了很大成功，他們利

11、用易錯PCR 和突變體DNA 改組辦法，并進(jìn)行提升溫度篩選條件進(jìn)行重組體篩選，使枯草桿菌蛋白酶最適催化溫度提升了17（65） 在最適溫度下半衰期增長了200倍。 改進(jìn)酶蛋白底物專一性 依據(jù)酶蛋白在生產(chǎn)中應(yīng)用特點，能夠有目的地通過度子定向進(jìn)化，提升或減少底物專一性。通過定向進(jìn)化，減少Km值實例諸多，通過對進(jìn)化酶蛋白動力學(xué)研究，證實諸多通過催化效率進(jìn)化酶Km值大大減少。 通過酶蛋白分子相應(yīng)用環(huán)境適應(yīng)能力 許多酶蛋白催化適應(yīng)環(huán)境是在長期生物體內(nèi)催化環(huán)境進(jìn)化形成，而在使用中，很難模擬體內(nèi)催化環(huán)境，通過定向進(jìn)化，能夠提升酶蛋白對催化環(huán)境適應(yīng)能力。如：在洗滌劑生產(chǎn)中，添加枯草桿菌蛋白酶，以增長洗滌劑去污能

12、力，添加去脂肪酶增長去油漬能力，而這些酶需要有特定金屬離子作為配基時，才干發(fā)揮良好催化活性，而在洗滌過程中，往往在洗滌劑中都加有去離子熬合劑，對酶蛋白不利，利用定向進(jìn)化改造酶蛋白適應(yīng)環(huán)境極為必要。Bryant報道利用定向進(jìn)化辦法，對枯草桿菌蛋白酶改造，清除了結(jié)合Ca環(huán)突結(jié)構(gòu)，取得了一株產(chǎn)不依賴Ca蛋白酶枯草桿菌菌株。第4頁第4頁Ch6-3 酶基因定點突變定點突變是對已知序列基因(或DNA)中任意指定位置進(jìn)行突變技術(shù)，它又能夠分為寡核苷酸誘導(dǎo)和寡核苷酸置換兩大類。分別適合用于不同類型預(yù)先確定突變氨基酸位置突變試驗。第5頁第5頁Ch6-3 酶基因定點突變1.寡聚核苷酸誘導(dǎo)定點突變這項技術(shù)主要是利用

13、帶有預(yù)定突變序列寡核苷酸單鏈引物，在體外與原基因序列退火，誘導(dǎo)合成少許完整突變基因，然后，通過體內(nèi)增殖得到大量突變基因。這類技術(shù)最早應(yīng)用是Hutehison和Razill等人，分別用合成寡核苷酸引物誘導(dǎo)了X174單鏈?zhǔn)删wDNA嘌吟點突變。以后，逐步改用M13單鏈?zhǔn)删wDNA作為基因載體，突變技術(shù)也日趨成熟。 定點突變基本操作程序： (1)將酶基因(包括結(jié)構(gòu)基因和起動基因)克隆到M13(一個單鏈DNA噬菌體)上(或質(zhì)粒上)，由此得到模板(下列稱“正鏈”)。 (2)化學(xué)合成含有所需突變順序寡核苷酸引物，這段“突變引物”核苷酸順序，除預(yù)定突變部位外，其余順序與“正鏈”互補(bǔ)。 (3)合成含突變順序雙

14、鏈M13 DNA，即是將合成突變引物5端磷酸化后，與“正鏈”DNA退火，這時突變引物與“正鏈”欲突變部位，形成含錯誤配正確雙鏈，然后加入DNA聚合酶(慣用大腸桿菌DNA聚合酶I)和四種dNTP，將引物延伸，合成所有互補(bǔ)雙鏈、并由T4噬菌體DNA連接酶封口，得到共價閉環(huán)雙鏈DNA(cccDNA)。并用超離心或凝膠過濾等技術(shù)分離純化雙鏈DNA。 (4) 將雙鏈DNA轉(zhuǎn)染受體菌(比如大腸桿菌F株)使其擴(kuò)增。從所得到噬菌斑分離單鏈DNA。經(jīng)印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，把上述突變引物標(biāo)識532P作為探針，進(jìn)行雜交(退火)，此時突變型單鏈DNA與探針?biāo)谢パa(bǔ)，而野生型(未突變者)與探針之間，存在錯誤配對，

15、在高溫洗滌時，這種互補(bǔ)鏈，易解鏈，探針被洗掉，因而留下來互補(bǔ)鏈，也許是突變酶基因鏈。 (5)由篩選到含突變酶基因受體菌株，進(jìn)一步純化，分離DNA，測定突變部位順序，與預(yù)定序列相符者，即為所要求突變酶基因。 (6)將含有突變酶基因M13，轉(zhuǎn)化高效表示體菌、溶菌后即可收得大量突變酶。這個辦法有許多主要長處: 它能夠準(zhǔn)確地在基因預(yù)定位置導(dǎo)入任何所需突變，并有有效篩選手段取得突變基因； 它對目的基因本身結(jié)構(gòu)沒有任何附加要求(如要求它在某處含有某種限制位點之類)，能夠直接地用于各種需要突變基因； 這個辦法環(huán)節(jié)比較簡樸、技術(shù)比較成熟，因此，當(dāng)前在蛋白質(zhì)工程研究中得到了廣泛應(yīng)用。這個辦法也有一些缺點，最突出

16、一個缺點是突變基因產(chǎn)率較低，噬菌體后代帶有所需突變比率經(jīng)常遠(yuǎn)低于理論值(50)。在一些場合，尤其當(dāng)需要進(jìn)行較多突變工作時，突變率低是很不利，近年來，針對這一缺點，提出了許多改進(jìn)方案。第6頁第6頁Ch6-3 酶基因定點突變2.寡聚核苷酸置換定點突變 寡核苷酸誘導(dǎo)定點突變法，只適合用于將蛋白質(zhì)中某一氨基酸，轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)定另一個氨基酸。但假如事先不能擬定轉(zhuǎn)變產(chǎn)物，需將每一個也許代替氨基酸逐一試驗時候，就要同時進(jìn)行某一位點各種突變。適合這類要求突變辦法，就是寡核苷酸置換定點突變法。 這類辦法特點是，用帶有各種所需突變序列寡核苷酸，在體外直接置換目的基因中欲變部位而實現(xiàn)突變。由于是直接置換，因此不需要進(jìn)行退

17、火和誘導(dǎo)合成。然而置換過程需要限制性酶切和連接酶連接，因此必須在雙鏈DNA之間進(jìn)行。寡核苷酸是雙鏈，目的基因及其載體(質(zhì)?；?Phage M13)也是雙鏈。盒式突變(Cassette mutagenesis) 本辦法是這類技術(shù)代表。所謂盒(Cassette)就是指與目的基因欲變部位相應(yīng)化學(xué)合成一系列雙鏈寡核苷酸，它們帶有各種能選取突變序列。當(dāng)進(jìn)行突變處理時，依據(jù)試驗需要把各種突變“盒”插入目的基因中，如同把盒式錄音帶插入錄音機(jī)同樣，非常靈活以便，用此技術(shù)可使蛋白質(zhì)中某種氨基酸殘基一次分別為各種氨基酸取代。實例： 枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)活性中心涉及Ser-221殘基，與其鄰近是M

18、et-222。由于Met-222存在，使該酶易被氧化失活。由于事先無法擬定哪種氨基酸取代Met-222后會既改進(jìn)對氧化穩(wěn)定性，又不致猛烈減少酶活力，故采用這種盒式突變技術(shù)對該酶進(jìn)行修飾。完整枯草桿菌蛋白酶基因在質(zhì)粒PS4.5一個1.5KbEcoR I-BamHI消化片段中。 將此片段連接到噬菌體M13mp9上，構(gòu)成一個單鏈重組噬菌體DNA(M13mp9 SUBT)。 合成一個38體寡聚脫氧核苷酸引物，該引物缺失包括Met-222在內(nèi)10個核苷酸，并在其兩側(cè)分別創(chuàng)造了限制酶Kpn I和Pst I新切點。 以此核苷酸為引物，以M13mp9SUBT為模板，在DNA聚合酶I(Klenow)和T4 DNA連接酶催化下體外復(fù)制成新突變DNA分子。 用EcoRI-BamH I 消化后取得DNA片段，再克隆到穿梭質(zhì)粒pBS42上，取得質(zhì)粒p222。 用限制酶Kpn I和Pst I消化這個質(zhì)粒，形成切口，將5種雙鏈25體寡核苷酸混合物(庫)在連接酶催化下插入切口，形成五種不同重組質(zhì)粒。 用此混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。分離單菌落質(zhì)粒DNA，測定DNA序列，篩選突變質(zhì)粒即取得了目標(biāo)基因。 第7頁第7頁Ch6-