基因工程以及在醫(yī)藥上的應(yīng)用81課件

1、基因工程及其在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用 重組DNA技術(shù)DNA Recombination Technique 基因工程相關(guān)概念基因工程相關(guān)的酶學(xué)基因工程的載體目的基因的制備和分離方法載體與目的基因的連接重組體的鑒定與分析隆基因的表達(dá)本章主要內(nèi)容重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年 英國(guó)羅林研究所成

2、功的克隆了多莉一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念 克隆(clone) 來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)， 即無(wú)性繁殖。（一）DNA克隆2.克隆化(cloning) 細(xì)胞的分化潛能 全能性(totipotency)一個(gè)細(xì)胞在一定條件下具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能，稱為細(xì)胞的全能性(totipotency)。具有這種潛能的細(xì)胞稱為全能性細(xì)胞。細(xì)胞核全能性 DNA克隆目的: 分離獲得某一感興趣的基因或DNA; 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開

3、環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目 錄1.限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE)(1) 定義識(shí)別DNA的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)：限制外源DNA，保護(hù)自身DNA，穩(wěn)定細(xì)菌遺傳性狀。(2) 分類、作用、（基因工程技術(shù)中常用型）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。(3

4、)命名EcoR 屬 種 株 序Escherichia coli RY13株大腸桿菌 RY13株的第一種酶(4)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口 同功異源酶來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA

5、序列分析填補(bǔ)3末端2. DNA聚合酶3.TaqDNA聚合酶 (TagDNA polymerase) 是一種耐熱的依賴于DNA的D NA聚合酶，具有聚合酶活性，該酶最適反應(yīng)溫度為75 80 (1)具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而無(wú)53外切活性.。 常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等.5. Klenow片段6. DNA連接酶 (DNA ligase)功能:催化DNA中相鄰的5磷 酸基和3羥基末端之間形成 磷酸二酯鍵，使DNA切口封 合或使兩個(gè)DNA分子或片段 連接.功能:催化多聚核苷酸5羥基 末端磷酸化，或標(biāo)記探針.7. 多聚核苷酸激酶功能: 在3羥基末端進(jìn)行

6、種核 苷酸多聚物加尾8.末端轉(zhuǎn)移酶（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因組DNA (genomic DNA)功能:切除5末端磷酸基團(tuán)9.堿性磷酸酶 （三）基因載體 (cloning vector)1.概念：攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。來(lái)源分類：質(zhì)粒載體噬菌體載體病毒載體人工染色體載體用途分類：克隆載體表達(dá)載體 穿梭載體2. 常用載體:克隆載體(cloning vector)能使插入的外源DNA序列被復(fù)制、擴(kuò)增而不能表達(dá)，這樣的載體為克隆載體。表達(dá)載體(expression vector) 使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯，

7、表達(dá)出多肽鏈，這樣的載體稱為表達(dá)載體。這類載體中含有來(lái)源不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，即具備原核細(xì)胞復(fù)制所需的序列結(jié)構(gòu)，又具有能使外源片段在真核細(xì)胞表達(dá)所需的結(jié)構(gòu)元件和相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因,所以能在兩種受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)，克隆的外源基因在此類載體直接從一種受體轉(zhuǎn)入另一種受體中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)穿梭載體（shuttle vector)3.載體具備以下條件:1.具有自我復(fù)制能力具有多個(gè)單一限制性酶切位點(diǎn)具有選擇性遺傳標(biāo)記分子量小，拷貝數(shù)高具有較高的遺傳穩(wěn)定性 松弛型的復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)、 篩選標(biāo)記. 常見:質(zhì)粒、噬菌體克隆載體必需結(jié)構(gòu):具有復(fù)制子，篩選標(biāo)記，位于多克隆位點(diǎn)的上下游具有轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動(dòng)子，起始密碼

8、子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 概念: 存在于細(xì)菌染色體外的能獨(dú)立復(fù)制的雙鏈閉環(huán)的DNA分子。質(zhì)粒 (plasmid)分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制具有某些遺傳標(biāo)志, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些 遺傳性狀；具有多個(gè)限制酶的單一位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)） 質(zhì)粒特點(diǎn):細(xì)菌質(zhì)粒質(zhì)粒的復(fù)制類型嚴(yán)謹(jǐn)型（strigent plasmid)：復(fù)制與宿主染色體同步受宿主染色體復(fù)制的限制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)低約份拷貝松弛型（relaxed plasmid):復(fù)制不受宿主染色體復(fù)制的限制可獨(dú)立復(fù)制，在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)高基因工程常用載體常用質(zhì)粒載體種類：pBR322pUCpBR3

9、22:人工構(gòu)建重要質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：具有較小的分子量具有兩種抗生素抗性基因，可作為篩選標(biāo)記具有高拷貝數(shù)是松弛型質(zhì)粒目 錄pUC質(zhì)粒特點(diǎn)：來(lái)源于pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)具有兩種抗生素抗性基因，但基因內(nèi)無(wú)核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)含有大腸桿菌半乳糖苷酶-肽段編碼基因統(tǒng)稱LacZ基因靠近LacZ基因端有一段多克隆位點(diǎn)，影響LacZ基因功能含有一個(gè)調(diào)節(jié) LacZ基因表達(dá)的阻遏蛋白基因LacIpUC質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：具有更小的分子，更高的拷數(shù)適于組織化學(xué)檢測(cè)重組體噬菌體(phage) 噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)載體系統(tǒng)分類： M13噬菌體

10、DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列左臂右臂非必需序列重組分子左臂右臂不能包裝的病毒顆粒左臂右臂插入單一酶切位點(diǎn)或一對(duì)內(nèi)切酶位點(diǎn)噬菌體DNA改造系統(tǒng)左臂右臂粘性質(zhì)粒(cosmid)結(jié)合質(zhì)?？寺≥d體和噬菌體克隆載體的優(yōu)點(diǎn)結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒DNA接上噬菌體 粘性末端(cos).粘性質(zhì)粒(cosmid)：具有噬菌體 粘性末端特性具有質(zhì)粒耐藥性標(biāo)記具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)具有高容量的克隆能力接上真核細(xì)胞復(fù)制子和啟動(dòng)子及選擇標(biāo)記，就能在真核細(xì)胞中存在和表達(dá)粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體 (bacterial ar

11、tificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其它（四）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因組DNA (genomic DNA)（一）目的基因的獲取1. 化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。2.基因組DNA文庫(kù)(genomic DNA library)3. cDNA文庫(kù)(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)（見第22章） 化學(xué)合成獲取目的基因* 化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序

12、列分 子 文 庫(kù)基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因(genomic DNA library)組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合* 從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因目 錄EcoR IGenomic LibraryInfect cells限制酶切位點(diǎn)限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 K

13、b 外源 DNA 片段 基因文庫(kù)目 錄cDNA文庫(kù)獲取目的基因(cDNA library)mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫(kù) 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制* 從cDNA文庫(kù)獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T目 錄引物cDNA 文 庫(kù)基于核酸雜交的篩選;基于抗原抗體反應(yīng)的篩選。在文庫(kù)中篩選目的基因原理 聚合酶鏈反應(yīng)獲取(polymerase chain reaction, PCR)5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 55

14、5 5 55PCR基本工作原理目 錄Cycle 35 5555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。目 錄 PCR的基本反應(yīng)步驟變性95C延伸72C退火Tm-5C模板DNA 特異性引物耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR體系基本組成成分（五）目的基因與載體的連接經(jīng)限制酶作用于目的基因與載體DNA，在連接酶催化下，來(lái)源不同雙鏈DNA片段，斷端重新形成，磷酸二酯鍵的過(guò)程連接原理粘性末端連接平端連接一端粘性末端與另一端平端連接連接方式：方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接Ba

15、m H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目 錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接Eco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目 錄定向克隆適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端或粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端T4 DNA連接酶催化平端連接 平端連接目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自

16、連目 錄在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接5335載體DNA5335目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 5 T(T)nT T(T)nT 5 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體目 錄由平端加上新的含有限制性酶切位點(diǎn)的接頭，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 人工接頭(linker)連接人工接頭及其應(yīng)用CCGAA

17、TTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目 錄（六）重組DNA導(dǎo)入受體菌受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷受體菌處于感受態(tài)(competent) 感受態(tài)(competent) : 指細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)可攝取外源性遺傳物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)重組成為染色體中的一部分,導(dǎo)致受體細(xì)胞某些遺傳性狀的改變.經(jīng)人工處理能吸收重組DNA分子敏感狀態(tài)的宿主細(xì)胞，稱之為人工感受態(tài)細(xì)胞導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)轉(zhuǎn)化 (transformation)： 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過(guò)

18、程.轉(zhuǎn)染 (transfection): 以噬菌體或病毒為載體構(gòu)建重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程.感染 (infection):以人工改造的噬菌體或病毒為載體構(gòu)建重組DNA分子,經(jīng)體外包裝成具有感染性噬菌體或病毒顆粒后,借助于噬菌體或病毒的蛋白外殼將重組DNA分子注入細(xì)菌或真菌細(xì)胞,從而使目的基因得以復(fù)制的過(guò)程.（七）重組體的篩選(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡1. 直接選擇法 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等.限制性內(nèi)切酶圖譜.雙脫氧終止法測(cè)序（sanger法）目 錄(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇

19、組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成DNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救目 錄 互補(bǔ)的檢測(cè)目 錄原位雜交目 錄核酸雜交Southern印跡目 錄雞的肌球蛋白的克隆和檢出目 錄重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目 錄 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過(guò) 程重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為 小 結(jié)分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 （八

20、）克隆基因的表達(dá)將外源目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱為外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)涉及目的基因的克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過(guò)程，表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化外源基因的表達(dá)步驟外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核表達(dá)系統(tǒng)就是將克隆的外源基因?qū)朐思?xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)快速、高效地表達(dá)基因產(chǎn)物，主要有大腸桿菌、芽孢桿菌及鏈霉菌系統(tǒng)等 E.coli表達(dá)體系最為常用組成：選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)原核表達(dá)體系表達(dá)載體pFASTBACI 的物理圖譜不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵

21、體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白E.coli表達(dá)體系的不足 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1融合型表達(dá)蛋白 所謂融合型表達(dá)是指將外源目的基因與宿主結(jié)構(gòu)基因相拼接構(gòu)建成融合基因進(jìn)行表達(dá)這樣產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的N末端為宿主基因序列（可以是原核DNA或其它DNA序列）編碼，C末端由外源目的基因編碼。 2非融合型表達(dá)蛋白 是指外源目的基因不與宿主基因融合，直接從起始密碼AUG開始在原核調(diào)控元件控制之下表達(dá)外源基因蛋白質(zhì)。 非融合型表達(dá)的蛋白質(zhì)具有類似天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)功能也更接近于體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)。但其缺點(diǎn)是容易被細(xì)菌蛋白酶降解。3分泌型表達(dá)蛋白 分泌型表達(dá)是利用具有信號(hào)肽編

22、碼序列的分泌型表達(dá)載體，將表達(dá)的蛋白質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)跨膜分泌到細(xì)胞基質(zhì)或細(xì)胞周質(zhì)中。 強(qiáng)啟動(dòng)子及其調(diào)控序列、 SD序列 SD序列下游攜帶有一段信號(hào)肽序列。 常用的信號(hào)肽有OmpA、PelB、PhoA 和Hly等。分泌型表達(dá)載體組成:需注意是，不同蛋白質(zhì)的分泌需要不同的信號(hào)肽， 大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌目 錄外源基因在真核表達(dá)克隆基因含有:原核克隆載體的復(fù)制子 抗性篩選基因 限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列， 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體大多是穿梭載體. 表達(dá)基因 真核細(xì)胞的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、 剪接信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) PolyA化信號(hào) 遺傳選擇標(biāo)記等組件，真核表達(dá)體系：酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)體系優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾,表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累真核細(xì)胞具有翻譯后加工系 統(tǒng)，可進(jìn)行糖基化、磷酸化、 乙?；刃揎?，使表達(dá)蛋白 形成正確的天然構(gòu)象，具有 完整的生物學(xué)活性。某些真核細(xì)胞可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物 直接分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中，簡(jiǎn)化了分 離純化的操作。真核表達(dá)體系