酶六章酶的固定化

1、酶六章酶的固定化第1頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶催化的優(yōu)點作為一種生物催化劑，酶參與生物體內(nèi)的各種代謝反應，具有專一性強、催化效率高及作用條件溫和等優(yōu)點。第2頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶催化的缺陷酶對環(huán)境影響十分敏感，各種物理、化學和生物因素（如溫度、壓力、電磁場、氧化、還原、有機溶劑、金屬離子、離子強度、pH、酶修飾和酶降解等）都可能使酶喪失生物活力。第3頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 在過去的科學研究和生產(chǎn)實踐中，酶一直都是以溶于水的游離狀態(tài)進行催化反應的，但游離酶即使在酶反應的最適條件下進行

2、催化，也還存在著容易失活、反應后不能回收等缺陷，有時不易與產(chǎn)物分開，影響產(chǎn)品提純及質(zhì)量。第4頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三設 想如果能設計一種方法，將酶束縛于特殊的相，使它與整體相（或整體流體）分隔開，但仍能進行底物和效應物（激活劑或抑制劑）的分子交換。這種固定化的酶可以象一般化學反應的固體催化劑一樣，既具有酶的催化特性，又具有一般化學催化劑能回收、反復使用等優(yōu)點，并且生產(chǎn)工藝可以連續(xù)化、自動化。第5頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三進展經(jīng)過40多年的研究和發(fā)展，酶的固定化技術取得了長足的進步。它不僅在理論研究（如闡明酶作用機理）上發(fā)揮獨

3、特作用，在實際應用上也顯示出強大威力。用這種技術不僅能穩(wěn)定酶，改變酶的專一性、提高酶活力，從而改善酶的種種特性，使之更符合人類要求，而且還能創(chuàng)造適應特殊要求的新酶。第6頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三現(xiàn)狀人們對固定化酶極感興趣，因為其性質(zhì)比可溶性酶及其相關技術優(yōu)越，對固定化酶的利用也與日俱增。第7頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三固定化酶的定義所謂固定化酶，是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進行反應，反應后的酶可以回收重復使用。不管用何種方法制備的固定化酶，都應該滿足上述固定化酶的條件。第8頁，共158頁，2022年，5月20日，

4、20點59分，星期三 固定化酶與游離酶相比，具有下列優(yōu)點（l）極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；（2）可以在較長時間內(nèi)進行反復分批反應和裝 柱連續(xù)反應；（3）在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；（4）酶反應過程能夠加以嚴格控制；（5）產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工 藝；（6）較游離酶更適合于多酶反應；（7）可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。 第9頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 固定化酶是二十世紀五十年代開始發(fā)展起來的一項新技術、最初是將水溶性酶與不溶性載體結(jié)合起來，成為不溶于水的酶的衍生物，所以曾叫過“水不溶酶”（water

5、 insoluble enzyme）和“固相酶”（solid phase enzyme）。第10頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 但是后來發(fā)現(xiàn)，也可以將酶包埋在凝膠內(nèi)或置于超濾裝置中，高分子底物與酶在超濾膜一邊，而反應產(chǎn)物可以透過膜逸出，在這種情況下，酶本身仍處于溶解狀態(tài)，只不過被固定在一個有限的空間內(nèi)不能再自由流動。第11頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 因此，用水不溶酶或固相酶的名稱就不恰當了。第12頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 固定化酶正式定名 在1971年第一屆國際酶工程會議上，正式建議采用“固定化

6、酶”（immobilized enzyme）的名稱。第13頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三歷史上較大的時事件1916年，Nelson & Griffin “酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer & Schleith 第一次實現(xiàn)了酶的固 定化1960年，千細一郎，開始了氨基?；腹潭ɑ芯?969年，千細一郎成功的將固定化氨基?；笐糜?DL-AA的光學分析上1971年，固定化酶名稱提出，Immobilized enzyme第14頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶的固定化方法第1

7、5頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三固定化酶的制備原則固定化酶的應用目的、應用環(huán)境各不相同，而且可用于固定化制備的物理、化學手段、材料等多種多樣。第16頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 制備固定化酶要根據(jù)不同情況（不同酶、不同應用目的和應用環(huán)境）來選擇不同的方法，但是無論如何選擇，確定什么樣的方法，都要遵循幾個基本原則第17頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三原則1必須注意維持酶的催化活性及專一性，保持酶原有的專一性、高效催化能力和在常溫常壓下能起催化反應的特點。第18頁，共158頁，2022年，5月20日，20點5

8、9分，星期三原則2固定化應該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化。為此，用于固定化的載體必須有一定的機械強度，不能因機械攪拌而破碎或脫落。第19頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三原則3固定化酶應有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量，制備固定化酶時所選載體應盡可能地不阻礙酶和底物的接近。第20頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三原則4酶與載體必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復使用，因此，在制備固定化酶時，應使酶和載體盡可能地結(jié)合牢固。第21頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三原則5固定化酶應有最

9、大的穩(wěn)定性，在制備固定化酶時，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應液發(fā)生化學反應。第22頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三原則6固定化酶應能保持甚至超過原有酶液的活性，在制備固定化酶時，酶和載體結(jié)合部位不應是酶的活性中心或與維持酶高級空間結(jié)構(gòu)有關的基團，因此，應盡可能預先保護這些基團；第23頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三原則7固定化酶應易與產(chǎn)物分離，即能通過簡單的過濾或離心就可回收和重復使用；第24頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三原則8 固定化酶成本要低，應為廉價的、有利于推廣的產(chǎn)品，以便于工業(yè)使用。第25頁，共158

10、頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶的固定化方法酶的固定化方法很多，但對任何酶都適用的方法是沒有的。 第26頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶的固定化方法通常按照用于結(jié)合的化學反應的類型進行分類 固定化方法 分類非化學結(jié)合法結(jié)晶法分散法 物理吸附法離子結(jié)合法化學結(jié)合法 交聯(lián)法共價結(jié)合法包埋法 微囊法網(wǎng)格法第27頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三（一）非共價結(jié)合法1結(jié)晶法2 分散法3 物理吸附法4 離子結(jié)合法 第28頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三結(jié)晶法就是使酶結(jié)晶從而實現(xiàn)固定化的方法。對于晶體來說，

11、載體就是酶蛋白本身。提供了非常高的酶濃度。對于活力較低的酶來說，這一點就更具優(yōu)越性。第29頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三結(jié)晶法的局限性在不斷的重復循環(huán)中，酶會有損耗，從而使得固定化酶濃度降低。第30頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三2 分散法通過酶分散于水不溶相中從而實現(xiàn)固定化的方法。對于在水不溶的有機相中進行的反應，最簡單的固定化方法是將干粉懸浮于溶劑中，并且可以通過過濾和離心的方法將酶進行分離和再利用。第31頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 對于用在水不溶性溶劑中的固定化酶，有許多途徑可以提高它們的反應速率

12、第32頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三正確的體系和貯存狀態(tài)使酶粉末充分分散，將有助于提高活力。在干燥過程中，加入多種化合物有助于酶的分散，這些化合物也作為穩(wěn)定劑和保護劑發(fā)揮作用。第33頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三通過與親脂化合物的共價連接 能增加酶在有機相中的溶解度可以通過將其包埋在膜體系中或通過多相反應來實現(xiàn)酶的固定化。第34頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶的固定化。將酶簡單地吸附到多孔載體中就能顯著地增加單一催化中心的獲得，并且易于從產(chǎn)物中分離酶。交聯(lián)的晶體需要表面活性劑來補償它們在有機相中的低活力。

13、第35頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三3. 物理吸附法酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。第36頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三載體無機載體有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高嶺石、氧化鋁、硅膠、膨潤土、羥基磷灰石、磷酸鈣、金屬氧化物等；天然高分子載體有淀粉、白蛋白等；大孔型合成樹脂、陶瓷等載體也十分引人注目；具有疏水基的載體（丁基或已基-葡聚糖凝膠）可以疏水性吸附酶，以及以單寧作為配基的纖維素衍生物等載體。第37頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三物理吸附法也能固定微生物細胞，并有可能在研究此法中開發(fā)出

14、固定化增殖微生物的優(yōu)良載體。第38頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 物理吸附法具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結(jié)構(gòu)變化少的優(yōu)點，因而酶活力損失很少。若能找到適當?shù)妮d體，這是很好的方法。但是它有酶與載體相互作用力弱、酶易脫落等缺點。 第39頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三4. 離子結(jié)合法酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。第40頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三載體陰離子交換劑如DEAE-纖維 素，DEAE-葡聚糖凝膠， Amberlite IRA-93，410， 900；陽離子交換劑如，C

15、M-纖維 素，Amberlite CG-50，IRC- 50，IR-120，Dowex-50等。第41頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三離子結(jié)合法的優(yōu)點操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的 氨基酸殘基不易被破壞，能 得到酶活回收率較高的固定 化酶。第42頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三缺點載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度高的條件下進行反應時，酶往往會從載體上脫落。第43頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 離子結(jié)合法也能用于微生物細胞的固定化，但是由于微生物在使用中會發(fā)生自

16、溶。用此法要得到穩(wěn)定的固定化微生物較為困難。第44頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 迄今已有許多酶用離子結(jié)合法固定化，例如1969年最早應用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化氨基酰化酶就是使用多糖類陰離子交換劑DEAE-葡聚糖凝膠固定化的。第45頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三（二）化學結(jié)合法1 共價結(jié)合法2 交聯(lián)法第46頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三共價偶聯(lián)法第47頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯(lián)試劑相互交

17、聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶第48頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三共價結(jié)合法酶與載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法方法：將載體有關基團活化，然后與酶有關基團發(fā)生偶聯(lián)反應。另一種是在載體上接上一個雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。第49頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三可與載體共價結(jié)合的酶的功能團或氨基、或-羧基、巰基、 羥基、咪唑基、酚基等。參與共價結(jié)合的氨基酸殘基不應是 酶催化活性所必需的，否則往往造 成固定后的酶活性完全喪失。第50頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三共價

18、結(jié)合法與離子結(jié)合法或物理吸附法相比的優(yōu)點酶與載體結(jié)合牢固，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。第51頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三缺陷反應條件苛刻，操作復雜；會引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)變化，破壞部分活性中心。 因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般為30左右，甚至底物的專一性等酶的性質(zhì)也會發(fā)生變化。第52頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三所用載體分三類天然有機載體（如多糖、蛋白質(zhì)、細 胞），無機物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍等）第53頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 載體的活化方

19、法依載體性質(zhì)各不相同第54頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三羥基聚合物 纖維素、葡聚糖、瓊脂糖及膠原等可用溴化氰法、活化酯法、環(huán)氧化法及三嗪法等。第55頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三溴化氰法第56頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 溴化氰法能在非常溫和條件下與酶蛋白的氨基發(fā)生反應，它已成為近年來普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氫活化的瓊脂糖已在實驗室廣泛用于制備固定化酶以及親和層析的固定化吸附劑。 第57頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三活化酯法第58頁，共158頁，2022年，5月20

20、日，20點59分，星期三環(huán)氧化法第59頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三三嗪法 三氯-均-三嗪 三氯-均-三嗪纖維素 第60頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三醛基載體纖維素葡聚糖經(jīng)過碘酸氧化或用二甲基砜氧化裂解葡萄糖環(huán)，產(chǎn)生二醛高聚物，每個葡萄糖分子含二個醛基。第61頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三第62頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三羧基載體第63頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三多胺載體第64頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三第65

21、頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三無機載體可采用直接法和涂層法（用活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂層）第66頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 第67頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 交聯(lián)法用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物與微生物細胞之間交聯(lián)的固定化方法。與共價結(jié)合法一樣也是利用共價鍵固定酶的，所不同的是它不使用載體。第68頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三參與交聯(lián)反應的酶蛋白的功能團N末端的-氨基賴氨酸的-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巰基組氨酸的咪唑基等第69頁，共158頁，2022年，

22、5月20日，20點59分，星期三交聯(lián)劑形成希夫堿的戊二醛，形成肽鍵的異氰酸酯，發(fā)生重氮偶合反應的雙重氮聯(lián)苯 胺或N，N-乙烯雙馬來亞胺等。 最常用的交聯(lián)劑是戊二醛。第70頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三第71頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三特點交聯(lián)法反應條件比較激烈，固定化的酶活回收率一般較低，盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應時間將有利于固定化酶比活的提高。 第72頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 （三）包埋法網(wǎng)格型微囊型第73頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三網(wǎng)格型將酶或微生物包埋在高

23、分子凝膠細微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型第74頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三網(wǎng)格型第75頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三微囊型將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。第76頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三微囊型第77頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三特點包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進行結(jié)合反應，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率較高。但是在包埋時發(fā)生化學聚合反應，酶容易失活，必須巧妙設計反應條件。第78頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三由于只有小分子可以通

24、過高分子凝膠的網(wǎng)格擴散，并且這種擴散阻力還會導致固定化酶動力學行為的改變，降低酶活力。因此，包埋法只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶，對于那些作用于大分子底物和產(chǎn)物的酶是不適合的。第79頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三常用的載體材料1. 網(wǎng)格型聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏樹脂等合成高分子化合物淀粉、蒟蒻粉、明膠、膠原、海藻酸和角叉菜膠等天然高分子化合物。第80頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三合成高分子化合物常采用單體或預聚物在酶或微生物存在下聚合的方法，溶膠狀天然高分子化合物則在酶或微生物存在下凝膠化。第81頁，共158頁，2022年，5月2

25、0日，20點59分，星期三 網(wǎng)格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。第82頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三2. 微囊型微囊型固定化酶通常直徑為幾微米到幾百微米的球狀體，顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物和產(chǎn)物擴散，但是反應條件要求高，制備成本也高。制備微囊型固定化酶方法。界面沉淀法界面聚合法二級乳化法：第83頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三（1）界面沉淀法利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度極低而形成皮膜將酶包埋。第84頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三例子先將含高濃度血紅蛋白的酶溶液在水不互

26、溶的有機相中乳化，在油溶性的表面活性劑存在下形成油包水的微滴，再將溶于有機溶劑的高聚物加入乳化液中，然后加入一種不溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油水界面上沉淀、析出、形成膜，將酶包埋，最后在乳化劑的幫助下由有機相移入水相第85頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三方法的特點條件溫和，酶失活少，但要完全除去膜上殘留的有機溶劑很麻煩。第86頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 作為膜材料的高聚物有硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。第87頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三（2）界面聚合法利用親水性單體和疏水性單體在界面

27、發(fā)生聚合的原理包埋酶。第88頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三例子將含10血紅蛋白的酶溶液與1，6-己二胺的水溶液混合，立即在含1% Span-85的氯仿-環(huán)乙烷中分散乳化，加入溶于有機相的癸二酰氯后，便在油-水界面上發(fā)生聚合反應，形成尼龍膜，將酶包埋。除尼龍膜外還有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。第89頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三方法的特點制備的微囊大小能隨乳化劑濃度和乳化時的攪拌速度而自由控制，制備過程所需時間非常短。但在包埋過程中由于發(fā)生化學反應會引起酶失活。第90頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三（3）二級乳

28、化法酶溶液先在高聚物（常用乙基纖維素、聚苯乙烯等）有機相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次級乳化液，當有機高聚物溶液固化后，每個固體球內(nèi)包含著多滴酶液。第91頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三方法的特點制備比較容易，但膜比較厚，會影響底物擴散。第92頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 此外還有脂質(zhì)體包埋法，由表面活性劑和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物或產(chǎn)物的膜透過性不依賴于膜孔徑大小，而只依賴于對膜成分的溶解度，因此可加快底物透過膜的速度。 第93頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三各種固定化酶方法的優(yōu)缺點比

29、較特性物理吸附法離子結(jié)合法包埋法共價結(jié)合法交聯(lián)法制備易易易難難結(jié)合力中弱強強強酶活力高高高中中底物專一性無變化無變化無變化有變化有變化再生可能可能不可能不可能不可能固定化費用低低中中高第94頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三包埋、共價結(jié)合、共價交聯(lián)三種雖結(jié) 合力強、但不能再生、回收；吸附法制備簡單，成本低，能回收再 生，但結(jié)合差，在受到離子強度、pH 變化影響后，酶會從載體上游離下來。 在使用價格較高的酶與載體時可行；包埋法各方面較好，但不適于大分子底 物和產(chǎn)物。沒有一個方法是十全十美的，幾種方法各有利弊第95頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期

30、三固定化酶的性質(zhì) 第96頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 固定化是一種化學修飾，酶本身的結(jié)構(gòu)必然受到擾動，同時酶固定化后，其催化作用由均相移到異相，由此帶來的擴散限制效應、空間障礙、載體性質(zhì)造成的分配效應等因素必然對酶的性質(zhì)產(chǎn)生影響。第97頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三1 影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質(zhì)取決于 所用的酶及載體材料的性質(zhì)。酶和載體之間相互作用使固定 化酶具備了化學、生物化學、 機械及動力學方面的性質(zhì)。 第98頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三成分參數(shù)酶生物化學性質(zhì)分子量，輔基，蛋白質(zhì)表

31、面的功能基團，純度（雜質(zhì)的失活或保護作用）動力學參數(shù)專一性，pH及溫度曲線，活性及抑制性的動力學參數(shù)，對pH，溫度，溶劑，去污劑及雜質(zhì)的穩(wěn)定性。載體化學特征化學組成，功能基，膨脹行為，基質(zhì)的可及體積，微孔大小及載體的化學穩(wěn)定性 機械性質(zhì)顆粒直徑，單顆粒壓縮行為，流動抗性（固定床反應器），沉降速率（流體床），對攪拌罐的磨損。固定化酶固定化方法 所結(jié)合的蛋白，活性酶的產(chǎn)量，內(nèi)在的動力學參數(shù)（即無質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應的性質(zhì)）質(zhì)量轉(zhuǎn)移效應分配效應（催化劑顆粒內(nèi)外不同的溶質(zhì)濃度），外部或內(nèi)部（微孔）擴散效應；這些給出了游離酶在合適反應條件下的效率。穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性(表示為工作條件下的活性降低)，貯藏穩(wěn)定性效能生

32、產(chǎn)力（產(chǎn)品量/單位活性或酶量），酶的消耗（酶單位數(shù)/公斤產(chǎn)品）固定化酶的特征參數(shù) 第99頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三2 固定化后酶活性變化 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生改變。第100頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三例如 用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30%，而對低分子底物苯酞精氨酸-對硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般認為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。第101頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 在同一測定條件下，固定化酶的活

33、力要低于等摩爾原酶的活力的原因可能是：酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會有 所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），會直接影響到活性中心對 底物的定位作用；內(nèi)擴散阻力使底物分子與活性中心的接 近受阻；包埋時酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大 分子底物不能過膜與酶接近。第102頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三值得注意的是也有個別情況，酶在固定化后反 而比原酶活力提高。原因可能是偶聯(lián)過程中酶得到化 學修飾，或固定化過程提高了酶 的穩(wěn)定性。 第103頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三3 固定化對酶穩(wěn)定性的影響 穩(wěn)

34、定性是關系到固定化酶能否實際應用的大問題第104頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三酶的穩(wěn)定性包括 熱穩(wěn)定性 對各種有機試劑穩(wěn)定性 對酶抑制劑的穩(wěn)定性 對不同pH（酸度）穩(wěn)定性 對蛋白酶穩(wěn)定性 貯存穩(wěn)定性 操作穩(wěn)定性第105頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三在大多數(shù)情況下酶經(jīng)過固定化后其穩(wěn)定性都有所增加，這是十分有利的。第106頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 Merlose曾選擇50種固定化酶，就其穩(wěn)定性與固定化前的酶進行比較，發(fā)現(xiàn)其中有30種酶經(jīng)固定化后穩(wěn)定性提高，12種酶無變化，只有8種酶穩(wěn)定性降低。第107頁

35、，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三熱穩(wěn)定性 固定化酶的穩(wěn)定性變化固定化酶；2. 自然酶第108頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因，可能有以下幾點：固定化后酶分子與載體多點連接 ，可防止酶分子伸展變形。酶活力的緩慢釋放。抑制酶的自降解。將酶與固態(tài)載 體結(jié)合后，由于酶失去了分子間 相互作用的機會，從而抑制了降 解。第109頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 然而，由于目前尚未找到固定化方法與穩(wěn)定性之間規(guī)律性，因此要預測怎樣才能提高穩(wěn)定性還有一定困難，但大多數(shù)情況下酶經(jīng)過固定化后穩(wěn)定性提高了。第1

36、10頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三4 固定化酶的最適溫度變化酶反應的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應速度的綜合結(jié)果。由于固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是非常有利的結(jié)果。當然，也有報道最適溫度不變或下降的。第111頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三5 固定化酶的最適pH變化酶由蛋白質(zhì)組成，其催化能力 對外部環(huán)境特別是pH非常敏感。酶固定化后，對底物作用的最適 pH和pH-活性曲線常常發(fā)生偏移 第112頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 pH對固定化前后天冬酰胺酶活力的影響1.固定化酶；2.游離酶第

37、113頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三6 固定化酶的米氏常數(shù)（Km）變化固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的 帶電性能變化。與溶液酶相比，固定化酶即使在溶液 的底物濃度較低時，也可達到最大反 應速度，即固定化酶的表觀Km值低于 溶液的Km值；簡單說，由于高級結(jié)構(gòu)變化及載體影 響引起酶與底物親和力變化，從而使 Km 變化。第114頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 輔酶的固定化第115頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三輔酶的定義 約1/3的酶的催化作用得以進行需要存在另一種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的化合物，這些小分子物質(zhì)統(tǒng)稱輔因子

38、，它們的存在是酶表現(xiàn)其催化作用的必要條件，缺少它們，酶就不能表達其活性。第116頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三輔酶的分類無機輔因子，是簡單的金屬 離子，例如Mg2+，Mn2+等有機輔因子，是一種與酶蛋白 或緊或松地聯(lián)結(jié)在一起的有機 物質(zhì)。第117頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三其中有機輔因子有兩類 輔酶 輔基第118頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三輔酶（酶間載體）作用是從某反應向另一反應傳遞物質(zhì)。它們與酶蛋白結(jié)合得比較松散，并且往往能夠通過透析法除去。第119頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59

39、分，星期三例 脫氫酶反應中需要的輔酶I（NADH和NAD+）和輔酶II（NADPH和NADP）能傳遞電子，連接酶在催化生物合成反應中所需要的ATP能傳遞磷酸基，以及輔酶A（CoA）能傳遞乙?；取５?20頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三輔基（酶間傳遞）與酶蛋白結(jié)合相當緊密，用透析法不易除去，必須經(jīng)過一定的化學處理才能使之分離。它是酶活性中心的組成部分。第121頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三例如過氧化氫酶中的鐵卟啉，黃素酶類中的黃素核苷酸（FMN和FAD）及B6、B12等。第122頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期

40、三輔基/輔酶和維生素維生素 脂溶性維生素： A D E K 維生素 硫辛酸（氧化型） 水溶性維生素：Vc VB: B1 B2 B3（泛酸） B5(PP) B12（氰鈷胺素） B6 (吡哆醇/醛/胺） B7 (生物素 ） 硫辛酸（還原型）第123頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三2.輔基輔酶在酶促反應中的作用 傳遞電子 、 原子或某些基團傳遞氫的輔基/輔酶 1. 輔酶I/輔酶II及維生素PP 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD/ CoI ） 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADP/CoII） NAD+（ NADP+ ） NAD(P )H + H+2H+ , 2e-2H+ ,2

41、e第124頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三2. 黃素核苷酸和維生素B2 （1）黃素單核苷酸（FMN) (2)黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD) FMN （FAD) FMNH2（FADH2) 3.維生素C（抗壞血酸） 4.泛醌（輔酶Q) 5.谷胱甘肽 2GSH GSSG +2H+ , +2e-2H+ ,-2e-2H+2H+ +2H+2H第125頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三二.傳遞電子的輔基鐵卟啉 Fe 3+ Fe 2+三.轉(zhuǎn)移基團的輔基/輔酶1.傳遞磷酸根的輔酶腺苷磷酸酯 (ATP/ADP/AMP)轉(zhuǎn)移磷?；?ATP + S ADP + P-

42、S轉(zhuǎn)移糖基 ATP + 糖-P ADP-糖 + PPi 轉(zhuǎn)移AMP ATP + FMN FAD + PPi 轉(zhuǎn)移腺苷 ATP + Met + H2O 腺苷- Met + PPi + Pi 能量的載體 ATP + H2O ADP + Pi+e-e第126頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三三.轉(zhuǎn)移基團的輔基/輔酶2.脫羧的輔酶硫胺素焦磷酸（TPP) 硫胺素+ATP TPP + AMP3.轉(zhuǎn)移?；妮o酶（1）輔酶A和泛酸CoA-SH + RCOOH CoA-S-COR + H2O CoA-S-COR +底物 底物- COR + CoA-SH（2）硫辛酸和VB1 mg硫胺素激

43、酶第127頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三(2）硫辛酸和VB1 第128頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三4.轉(zhuǎn)移氨基的輔酶和VB6 磷酸吡哆醛（PLP)/磷酸吡哆胺(PMP) AA 酮酸 PCHO PCH2NH2 5.固定CO2的輔酶生物素和VB7 6.轉(zhuǎn)移一碳基團的輔酶 (1)四氫葉酸（FH4) (2)鈷銨素和VB12 酮酸AA第129頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 有機輔因子分子中具有某些特殊的化學基團，它們能直接與底物反應，起著遞氫、遞電子或遞某些化學基團的作用。第130頁，共158頁，2022年，5月

44、20日，20點59分，星期三不少酶還同時需要金屬離子和有機輔因子。輔基和輔酶與對應的酶有專一的親和性，酶蛋白與有機輔因子相結(jié)合便形成全酶由于有機輔因子的價格較昂貴，所以在工業(yè)上應用全酶的關鍵是有機輔因子的保留和再生。第131頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 在反應之后，大多數(shù)有機輔因子不能自行再生，其結(jié)構(gòu)往往發(fā)生改變。 因此，它們在繼續(xù)使用之前，必須進行回收和再生，由于輔基與酶蛋白的結(jié)合比較牢固，通常可以用超濾膜截留等物理方法進行回收。第132頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 對于輔酶來說，直接用超濾膜截留并不理想，因為輔酶分子一般較小，

45、所用的超濾膜必須十分致密，才能阻止它的流失，這樣勢必增加流體的流動阻力，使反應產(chǎn)率降低。第133頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 為使輔酶能在酶反應系統(tǒng)中有效的參與反應，必需考慮輔酶的固定化。將輔酶固定在可溶性的或不可溶性的大分子載體上，這樣就便于回收再生。第134頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三輔酶的固定化方法第135頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三輔酶的固定化方法輔基的固定化輔酶的固定化第136頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三（一）輔基的固定化 應選擇合適的載體 間隔臂（手臂）的

46、選擇第137頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三理想的載體應具有以下的條件沒有特異性吸附具有多孔性有適合引入配基的官能團化學穩(wěn)定性具有適當?shù)臋C械強度等。第138頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三目前使用的載體主要有 瓊脂糖 纖維素玻璃珠合成高分子載體等第139頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三間隔臂（手臂）的選擇一般輔基分子和載體之間需要0.51.0 nm長的手臂考慮輔基的性質(zhì)，如：疏水性、親水性、離子性和體積大小等因素。 第140頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三要將輔基共價偶聯(lián)于載體上，首

47、先必須在不影響輔基活性的分子部位引入適當?shù)墓δ軋F。一般引入羧基或氨基后，與載體偶聯(lián)比較容易。如果輔基分子本身具有不參與催化活性的適當?shù)墓δ軋F時，就不必預先引入功能團。第141頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三 輔酶固定化所用的偶聯(lián)反應WSC：碳二亞胺；（a）與CNBr活化的瓊脂糖直接偶聯(lián)；（b）與具有間隔臂的載體偶聯(lián)。第142頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三（二）輔酶的固定化輔酶的固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M行適當?shù)幕瘜W修飾后用在超濾器中。第143頁，共158頁，2022年，5月20日，20點59分，星期三輔酶NAD+在瓊脂糖上的固定化第1