血液標志物對阿爾茨海默病診斷價值的再認識

1、血液標志物對阿爾茨海默病診斷價值的再認識隨著我國人口老齡化的加重，老年癡呆的發(fā)病率逐年上升。阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是老年癡呆中最常見的類型，約占60%80%。目前，我國60歲以上的AD患者約983萬，這將為患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔，已成為不容忽視的社會問題。時至今日AD仍無法治愈，目前應用于臨床的藥物僅能延緩疾病進展，并不能有效根治疾?。欢鳤D治療藥物的研發(fā)過程投入高、耗時長，且近年來所進行的期藥物臨床試驗幾乎均以失敗告終，因此AD的早期診斷、早期干預變得尤為重要。目前，AD的診斷主要依據(jù)臨床癥狀、認知量表評分、腦影像學以及分子生物學標志物的改變，其中分子生

2、物學標志物可較早反映神經(jīng)細胞結構和功能的變化，使得AD的診斷大大提前。腦脊液中的生物標志物（如A40、A42、tau和p-tau等）可直接反映AD患者的神經(jīng)病理損傷情況，從而為AD的診斷提供有力依據(jù)。然而，腦脊液標本采集是一項侵入性的操作，易引起不良反應，限制了其在健康人群篩查中的應用。因此，尋找特異性強、靈敏度高、創(chuàng)傷性小、易于采集的生物標志物成為了當前研究的熱點。一直以來，由于血腦屏障的存在，使得反映腦組織神經(jīng)病理損傷的生物標志物在血液中的豐度極低，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法、電化學發(fā)光技術受限于靈敏度難以有效定量檢測，因此既往的研究認為血液指標對于AD的診斷價值有限。近年來，隨著超敏檢測技術如單分

3、子免疫技術（single molecule array，SiMoA）和液相色譜-串聯(lián)質譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等的應用，血液標志物在AD中的診斷價值再次引起了研究者的廣泛關注。一、AD及其血液標志物AD是一種進展性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，分為臨床前期、輕度認知障礙期（mild cognitive impairment，MCI）以及癡呆期。AD的發(fā)生是多系統(tǒng)紊亂的結果，其病因十分復雜，存在多種假說，包括A蛋白級聯(lián)假說、tau蛋白過度磷酸化假說、神經(jīng)炎癥假說、膽堿能假說以及金屬離子紊亂假說等，這些假說的提出從

4、各自角度解釋了AD的發(fā)病機制，同時也為AD的診斷提供了更多可靠的生物標志物。腦組織中A蛋白沉積形成淀粉樣斑塊和tau蛋白過度磷酸化是AD的主要病理特征，淀粉樣斑塊過量產生或清除障礙均會導致A肽鏈聚集成為寡聚體，進而引起神經(jīng)細胞離子通道受阻、鈣穩(wěn)態(tài)改變及線粒體氧化應激增加等一系列病理改變。而作為一種微管相關蛋白，tau蛋白的過度磷酸化將導致自身微管結構破壞和神經(jīng)退行性病變，進而引起神經(jīng)纖維纏結，最終導致神經(jīng)元之間信號處理異常和神經(jīng)元細胞的凋亡。腦脊液中A42、A-40、p-tau等可以直接反映AD的病理改變，目前已被納入AD的診療指南。與腦脊液相比，血液檢測更具優(yōu)勢，血清神經(jīng)源性外泌體（neur

5、onally-derived exosome，NDE）中的A、tau蛋白可以自由穿過血腦屏障進入外周血且不受機體內其他因素的干擾，因此可更加精確地反映AD患者腦組織的神經(jīng)病理改變。近年來隨著超敏檢測技術的應用，A、p-tau等傳統(tǒng)標志物在血液中的價值被進一步發(fā)掘，有可能取代腦脊液檢測成為AD早期診斷的新方法。神經(jīng)炎癥被認為是繼A沉積和神經(jīng)纖維纏結之后的AD第三大病理特征。AD患者腦組織中A蛋白聚集導致小膠質細胞過度激活，通過釋放促炎因子來吞噬A蛋白，若A蛋白持續(xù)增加，超過小膠質細胞的清除能力，則會促發(fā)炎癥細胞因子的大量釋放，導致神經(jīng)炎癥和神經(jīng)毒性，引起認知功能損傷。除小膠質細胞介導的固有免疫參

6、與AD神經(jīng)炎癥過程外，適應性免疫如T、B淋巴細胞等在AD的發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用，通過檢測血漿中的炎癥因子、補體及淋巴細胞等免疫相關因子可進一步反映AD的病理改變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行損傷是AD的又一重要病理特征。神經(jīng)絲蛋白輕鏈（neuroflament protein light chain，NfL）是構成神經(jīng)元軸突中間纖維的特異性蛋白，是神經(jīng)元細胞骨架的重要成分，其異常表達與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在AD患者早期的病理改變中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性改變，一方面引起NfL升高，另一方面引起反應性星形膠質細胞增多，進而導致膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidi

7、c protein，GFAP）的過度表達，因此檢測血漿中NfL和GFAP的水平可反映AD早期的神經(jīng)病理損傷情況。二、血液標志物在AD中的診斷價值（一）血漿A42/A40A蛋白主要包括A40和A42，目前，多數(shù)學者認為在AD的診斷中，相較于單獨檢測A40或A42，血漿A42/A40有著更高的診斷價值。Ovod等運用LC-MS/MS檢測A42和A40在認知未受損者和AD患者血漿中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在AD患者血漿中A42/A40的比值降低，且該比值低的認知未受損者未來發(fā)生淀粉樣變性的概率約為89%。Prez-Grijalba等研究發(fā)現(xiàn)與認知未受損者相比，MCI患者血漿中A42/A40比值降低，該組患者

8、2年內進展為癡呆期的風險增加約70%。除了在癡呆期患者血漿中差異表達外，A42/A40在AD臨床前期的診斷中也具有一定價值，如Verberk等運用單分子免疫技術檢測血漿中A42和A40，發(fā)現(xiàn)在A+的受試者血漿中A42/A40顯著低于A-受試者，且A42/A40對于這2組的鑒別有著較高的敏感度（90%）和特異度（80%）。中國阿爾茨海默病癡呆診療指南（2020年版）指出：血漿A42/A40比值降低定義AD癡呆和MCI的性能高，其區(qū)分AD和MCI與健康對照的合并敏感度和特異度分別為0.85和0.97，AUC為0.92。（二）血漿p-tau蛋白根據(jù)磷酸位點的不同，p-tau主要有p-tau181、p

9、-tau231、p-tau217等，其中p-tau181可以較精確反映腦組織內神經(jīng)纖維纏結的負荷情況，并且與海馬體萎縮等AD的早期病理改變有著密切聯(lián)系，因此對于早期AD具有較好的提示作用。近年來，隨著超敏檢測技術的應用，血漿p-tau181在AD診斷中的價值被進一步肯定，其在MCI及AD癡呆患者血漿中的表達水平顯著高于認知未受損者，且血漿p-tau181高表達的認知未受損者（或MCI患者）進展為癡呆期的幾率更高，因此可用于AD疾病進展的監(jiān)測。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)血漿p-tau181和p-tau231在認知未受損的A+受試者中的表達水平顯著高于認知未受損的A-受試者，進一步表明了兩者在AD臨床前期

10、診斷中的價值。除了臨床前期，血漿p-tau231在AD臨床期診斷中也有著較高的價值，有研究認為相對于A-認知未受損者，p-tau231在AD患者血漿中顯著上調，診斷AUC為0.920.94，而在鑒別癡呆期與A-的MCI時，AUC為0.89。相較于p-tau181和p-tau231，血漿p-tau217可以更早提示AD的發(fā)生，Palmqvist等的研究發(fā)現(xiàn)PSEN1 E280A突變攜帶者血漿p-tau217水平隨年齡增長而升高，在24.9歲時與非攜帶者出現(xiàn)明顯差異，這比突變攜帶者出現(xiàn)輕度認知障礙的時間提前了約20年，可見p-tau217在AD患者的臨床前期就已經(jīng)升高，且這種變化發(fā)生于PET（正電

11、子發(fā)射型計算機斷層顯像）檢測出tau陽性之前。在鑒別AD與非AD方面，血漿p-tau181、p-tau231及p-tau217同樣表現(xiàn)突出，診斷AUC分別為0.94、0.93和0.96。（三）血液神經(jīng)退行性相關蛋白NfL可直接反映神經(jīng)元退行性損傷情況，其在腦脊液和血液中相關性很好（r值為0.700.97），是第一個被證實具有臨床價值的神經(jīng)特異性生物標志物。NfL對家族性AD具有較好的預測價值，Preische等的研究發(fā)現(xiàn)，相對于未突變者，攜帶AD相關基因（APP、PSEN1、PSEN2）突變的AD高風險人群在認知障礙發(fā)生前6.8年其血清NfL水平就已經(jīng)顯著升高，其中PSEN1 E280A突變攜

12、帶者血清NfL的升高要更早（22年前）。另有研究認為血漿NfL在A+認知未受損者中的表達水平顯著高于A-認知未受損者，表明血漿NfL對于散發(fā)性AD也有一定的提示作用。另外，MCI患者血漿NfL水平與其認知能力呈負相關，且高表達NfL的MCI患者更易進展為癡呆期。1項歷時11年的多中心隊列研究表明：相對于認知未受損者，血清NfL在MCI和癡呆期患者中均上調表達，它在認知未受損者中的平均值為32.1 ng/L，MCI為37.9 ng/L，癡呆期為45.9 ng/L，其對癡呆期的診斷價值最高，AUC為0.87。GFAP是另一種反映AD早期神經(jīng)病理損傷的標志物，Stocker等對768名受試者進行了長

13、達17年的跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)進展為AD的受試者在確診前917年，血漿GFAP水平就已經(jīng)顯著升高，這種變化要早于p-tau181和Nfl，而與穩(wěn)定型MCI患者相比，之后進展為癡呆期的MCI患者的血漿GFAP出現(xiàn)明顯的縱向增長。此外，血漿GFAP水平與AD患者的認知水平呈反比，血漿GFAP高水平表達的AD患者，其記憶評分顯著低于GFAP低表達的AD患者。由于血漿中NfL和GFAP的含量偏低，酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法難以測出，因此目前的研究大多選擇靈敏度更高的SiMoA方法。（四）免疫相關因子人體免疫系統(tǒng)失調所導致的神經(jīng)炎癥反應是AD的早期事件，炎癥因子釋放、免疫細胞浸潤以及補體系統(tǒng)的異常激活在AD的發(fā)生

14、發(fā)展過程中扮演著重要角色。1.神經(jīng)炎癥因子：在AD發(fā)病早期，A和APP（淀粉樣前體蛋白）通過誘導小膠質細胞、星形膠質細胞和神經(jīng)元釋放炎癥因子，而炎癥因子的釋放進一步促進了A沉積，形成惡性循環(huán)。目前研究較多的炎癥因子有C反應蛋白（C-reactionprotein，CRP）、白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）、IL-12等。其中，CRP作為炎癥反應的明星分子，其在AD中的診斷價值受到研究者的廣泛關注。一直以來，對于CRP在AD患者血漿中的表達情況并無一致結論，然而最近Krance等的薈萃分析認為，與健

15、康受試者相比，CRP在AD患者外周血中上調表達，有望成為AD的診斷標志物。近年來IL-1、IL-6和TNF-在AD中的表達情況仍存在不確定性，矛盾結論的出現(xiàn)或許與AD神經(jīng)炎癥內環(huán)境的紊亂有關。另外，炎癥相關因子血清可溶性髓樣細胞觸發(fā)受體2（soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 2，sTREM2）也參與了AD的神經(jīng)炎癥過程，它在AD患者大腦中上調表達并通過激活炎癥反應而致病。研究表明：AD患者外周血單核細胞中的sTREM2無論在mRNA水平還是蛋白水平都顯著高于對照組，且與AD的發(fā)病風險正相關。Zhang等最近的研究發(fā)現(xiàn)，s

16、TREM2在AD患者和認知未受損者血清中差異表達，其對AD的診斷敏感度較高為81.8%，AUC為0.677 3。2.免疫細胞在AD中的診斷價值：神經(jīng)炎癥誘導的免疫細胞浸潤是AD的特征之一，在AD的發(fā)病過程中，小膠質細胞、神經(jīng)元或內皮細胞釋放的促炎細胞因子和趨化因子可將外周單核細胞和T淋巴細胞等吸引到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進而靶向調節(jié)A蛋白的形成。既往的研究認為，AD患者外周血中淋巴細胞和嗜堿性粒細胞數(shù)量減少，而中性粒細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞則無明顯變化。近年來，隨著檢測方法的提高以及研究的進一步深入，越來越多的研究者將目光投向了T淋巴細胞亞群在AD診斷中的價值，他們發(fā)現(xiàn)AD患者外周血中的CD4+T

17、淋巴細胞水平升高，且升高程度與AD患者的認知缺陷密切相關。然而，AD患者外周血中CD8+T淋巴細胞的作用存在一定爭議，既往的研究認為CD8+T淋巴細胞在AD外周血中升高，而最近Xu和Jia的研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細胞在AD外周血中水平降低，這進一步揭示了AD發(fā)生過程中T淋巴細胞調節(jié)紊亂所導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫微環(huán)境惡化。除T淋巴細胞外，其他免疫細胞在AD的發(fā)病中也發(fā)揮了一定的作用，如Wang等最近的研究發(fā)現(xiàn)：相對于健康對照，AD患者外周血中靜息自然殺傷細胞、M0巨噬細胞以及活化肥大細胞的水平升高。由此可見，外周血免疫細胞的功能障礙可能是導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫環(huán)境惡化的因素之一，檢測外周血免疫細胞

18、及其亞群對AD的診斷具有一定的指導意義。3.補體在AD中的診斷價值：補體系統(tǒng)是人體先天免疫反應的重要組成部分，多種補體分子在AD的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。目前研究較多的補體有：補體因子H、凝聚素、血漿因子、C4d和iC3b等，其中凝聚素在AD中的作用備受研究者關注，既往的研究認為凝聚素是AD發(fā)病的風險因素之一，其在AD和MCI患者血漿中表達上調，且在進展型MCI患者血漿中的表達水平顯著高于穩(wěn)定型MCI。另有研究認為凝聚素在AD發(fā)病過程中發(fā)揮著神經(jīng)保護的作用，它作為伴侶蛋白可改變A蛋白的聚集性和毒性，以達到清除A蛋白的目的。然而隨著研究的逐漸深入，凝聚素對于AD的診斷面臨挑戰(zhàn)，如最近一篇綜合了

19、20項研究的薈萃分析認為：與健康對照相比，凝聚素在AD患者血漿中差異無統(tǒng)計學意義。除凝聚素外，其他補體分子（如C3、C4、C1-抑制子）也參與了AD的炎癥反應過程，而最新的研究發(fā)現(xiàn)C1q、C4a、C9在AD患者血漿中呈上調表達，進一步揭示了補體分子在AD診斷中的意義。（五）血液神經(jīng)源性外泌體蛋白超敏檢測技術的運用顯著降低了基質效應對A檢測的影響，提高了A蛋白檢測的靈敏度，然而由于血液中非腦組織來源的A蛋白（如血小板中的A蛋白）對檢測結果的干擾，檢測特異性還有待進一步提高。NDE可自由穿越血腦屏障而不受外界干擾，因此可以更加準確反映AD大腦組織的神經(jīng)病理改變，Jia等發(fā)現(xiàn)A、tau蛋白在外周血N

20、DE和CSF中的表達高度相關，且AD患者外周血NDE中的A42、t-tau和p-tau181的表達水平顯著高于遺忘性輕度認知障礙患者及健康對照，其診斷效能可與CSF相一致。突觸功能障礙及丟失是AD發(fā)生的早期事件，與AD患者的認知功能下降有著密切聯(lián)系，突觸相關蛋白Neurogranin、SNAP-25、synaptotagmin1、GAP43在AD患者血漿神經(jīng)源性外泌體和腦脊液中的表達具有相關性，它們在AD患者血漿NDE中下調表達，四者聯(lián)合檢測可將AD的診斷提前57年。（六）血液中微小RNA（microRNA，miRNA）MiRNA與神經(jīng)細胞的發(fā)育、分化和突觸可塑性相關，并參與包括AD在內的多種

21、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，約70%的miRNA位于大腦內，它們通過血腦屏障進入外周血，進而間接反映不同的神經(jīng)病理變化過程。MiRNA可通過靶向調控APP、A和tau相關基因，進而影響AD的發(fā)生發(fā)展，如miR-29c通過靶向調控BACE1調控A蛋白沉積，miR-200a-3p通過調控BACE1和PRKACB以保護神經(jīng)元免受A蛋白毒性和tau蛋白過度磷酸化的影響。Tan等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和miR-let-7d-5p在AD患者和健康對照人群血清中表達有差異，其中miR-342-3p在鑒別AD時有較高的特異度（70.1%）和敏感度（81.5%）。然而單一miRNA對于AD的診斷效能往往低于多種miRNA的聯(lián)合檢測，Leidinger等檢測了12個神經(jīng)相關的血漿miRNA，