中大生化與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)與事業(yè)聯(lián)系的較為緊密的熱點(diǎn)問題主要有以下幾種：1）真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控；2）細(xì)胞膜、膜系、受體與信號傳遞研究；3）的研究；4) 細(xì)胞工程，細(xì)胞生長、分化、衰老、，尤其是程序性細(xì)胞包括工程及體細(xì)胞核移植的研究。一、細(xì)胞培養(yǎng)常用方法1、細(xì)胞原代培養(yǎng)（primay culture） 又稱初代培養(yǎng)，即直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織、或、讓他們在體外維持與生長。原代細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞或組織剛離開機(jī)體，他們的生物狀態(tài)尚未發(fā)生很大的改變，一定程度上可反映他們在體內(nèi)的狀態(tài)，來源組織或細(xì)胞的特性，因此用于藥物實(shí)驗(yàn)尤其是藥物對細(xì)胞活動、結(jié)構(gòu)、代謝、有無毒性或作用等研究是極好工具。

2、常用的原代培養(yǎng)方法有組織快培養(yǎng)法及消化培養(yǎng)法。前者方法簡單，細(xì)胞也較易生長，尤其是培養(yǎng)心肌有時能觀察到心肌組織塊的搏動。細(xì)胞從組織塊外長并鋪滿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶后即可進(jìn)行傳代。2、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞生長至單層匯合時，便需要進(jìn)行分離培養(yǎng)否則會因無繁殖空間、營養(yǎng)耗竭而影響生長，甚至整片細(xì)胞脫離基質(zhì)懸浮起來直至。為此當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時必須傳代或再次培養(yǎng)，目的是借此繁殖的細(xì)胞，另一方面是防止細(xì)胞的。二、培養(yǎng)方法培養(yǎng)（an culture）是指用特殊的裝置使、原基或它們的一部分在體外存活，幷保持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)可模擬體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，用于觀察組織間的相互反應(yīng)、組織與細(xì)胞的分化以及外界因子包括藥物對

3、組織細(xì)胞的作用。培養(yǎng)方法很多，最經(jīng)典的方法即表玻皿培養(yǎng)法；一種最常用的方法是不銹鋼金屬網(wǎng)格法及 Wolff 培養(yǎng)法和擴(kuò)散盒培養(yǎng)法，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)情況選擇采用。三、放射自顯影術(shù)測定放射自顯影術(shù)（autoradiography）是利用放射性同位素電離輻射對核子乳膠的感光作用，顯示標(biāo)本或樣品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在緊密接觸的感光乳膠中下它存在的部位和強(qiáng)度，準(zhǔn)確顯示出形態(tài)與功能的定位關(guān)系?，F(xiàn)已可將放射自顯影術(shù)與電鏡以及生物分子結(jié)合起來。不但可以研究放射性物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布代謝，而且可以揭示核酸及其損傷等改變，目前已在生命科學(xué)各領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。四、分析技術(shù)染色質(zhì)或是遺傳物

4、質(zhì)在細(xì)胞水平的形態(tài)特征。前者是指當(dāng)細(xì)胞處于期時遺傳物質(zhì)經(jīng)堿性后，呈現(xiàn)出細(xì)絲狀彌漫結(jié)構(gòu)；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入期時，染色質(zhì)細(xì)絲高度螺旋化凝聚為形態(tài)有特征的。特別是在中期，后的達(dá)到最高程度的凝聚，稱為中期染色，是進(jìn)行形態(tài)觀察分析的最佳時分析應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣，主要用于以下幾方面：1）為臨床期。提供新；2）研究不育和發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)；3) 通過檢查性的，預(yù)防有異常患兒出生（愚型）；4）根據(jù)的多肽性進(jìn)行親子和異型配子的研究；結(jié)合 DNA 重組技術(shù)可以將定位于的具體區(qū)帶上。五、電鏡技術(shù)早在 1940 年，英國實(shí)用價值。1965 年英國大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡，但因分辨率低無科學(xué)儀器開始生產(chǎn)出商品掃描電鏡，其以顯著

5、優(yōu)點(diǎn)廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、電子學(xué)及勘探、冶金、國防、機(jī)械與輕工業(yè)等諸多領(lǐng)域，并已成為非常有用的研究工具。電鏡主要特點(diǎn)：1）景深大，較光學(xué)顯微鏡大幾百倍；2）圖像富有感，是圖象；3）圖像放大范圍大，光學(xué)顯微鏡有效放大一個實(shí)感的三維結(jié)構(gòu)倍數(shù)為 1000 倍左右，電鏡的放大倍數(shù)為幾百倍至 100 萬倍，掃描電鏡可放大十幾倍至幾十萬倍；4）分辨率高，掃描電鏡可達(dá) 63nm；5）樣品可在三度空間平移和旋轉(zhuǎn)，聚焦后可以任意放大倍數(shù)，而不需調(diào)整重新聚焦。六、細(xì)胞、細(xì)胞器、及細(xì)胞間質(zhì)的分離技術(shù)、1、 細(xì)胞的分離分離不同的細(xì)胞及亞細(xì)胞組分在現(xiàn)物學(xué)研究中起著重要的作用。如研究某種藥物治療白血病的機(jī)理

6、，需要分離培養(yǎng)人或動物的骨髓細(xì)胞，觀察藥物的細(xì)胞作用；研究與細(xì)胞生長分化有關(guān)的生長因子的作用，需將與此類因子有關(guān)的細(xì)胞分離出來；分離細(xì)胞膜，線粒體等細(xì)胞的亞組分，對于研究信號傳遞，某些遺傳疾病，也都是必不可少段。2、細(xì)胞膜的分離細(xì)胞內(nèi)的膜系統(tǒng)與細(xì)胞質(zhì)膜統(tǒng)稱為生物膜（biomembrane）,他們都有共同結(jié)構(gòu)和特征。首先要分離出形狀完整的、具有生物活性的、高純度的細(xì)胞膜，用于研究細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，以利于觀察膜在細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行能量交換及信息傳遞的過程。3、細(xì)胞核的分離細(xì)胞核作為一個功能，完整的保存遺傳物質(zhì)，幷指導(dǎo)RNA，后者為蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞組分所必需。因此細(xì)胞核分離是研究表達(dá)及細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)的

7、首要步驟。不同組織來源的細(xì)胞經(jīng)勻漿后，用分級離心或超聲波處理等方法進(jìn)行純化。4、溶酶體的分離溶酶體是處理細(xì)胞吞噬物的細(xì)胞器，含有高濃度的各種水解酶類，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的消化過程。溶酶體的分離常用于研究因溶酶體功能缺陷而引起的多種疾病。5、線粒體的分離線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場所，細(xì)胞活動所需要的能量，主要由粒體內(nèi)進(jìn)行氧化所產(chǎn)生的能量供給。線粒體關(guān)鍵是保持其完整性及高純度。6、細(xì)胞 DNA、RNA 分離與純化核酸是遺傳信息及表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸的提取與純化關(guān)鍵是保持核酸的完整性，但較，主要因?yàn)椋阂皇羌?xì)胞內(nèi)有活性很高的核糖核酸酶；二是酸堿等化學(xué)；三是高溫機(jī)械損傷等物理，需嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。七、細(xì)胞凋亡研究

8、方法細(xì)胞凋亡(apoptosis),又稱為程序性（programmed cell death,PCD）指的是有核細(xì)胞在一定條件下，通過激活其自身機(jī)制，尤其是開啟與關(guān)閉某些以及內(nèi)源性 DNA 內(nèi)切酶活化，導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞自然性的過程?？梢哉J(rèn)為細(xì)胞的這種方式是一種生理性的自發(fā)過程。為此有人也稱其為細(xì)胞。目前認(rèn)為程序性幾乎和細(xì)胞的增殖同樣重要，如果沒有細(xì)胞凋亡，不能形成與存活，或者發(fā)生疾病。只有通過細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使特定細(xì)胞群體在特定的時間和特定的部位。從而使機(jī)體在總體上保障其細(xì)胞數(shù)量，以及形態(tài)與功能的平衡。近年來如何用藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞也成為細(xì)胞凋亡的熱點(diǎn)之一。電鏡觀察是研究細(xì)胞凋亡的首選方法。八、原位雜

9、交原位雜交技術(shù)是將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合，用標(biāo)記的DNA 或RNA 為探針，在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特異互補(bǔ)的 DNA 或 RNA 序列。它分為三類：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已廣泛用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。原位 DNA 末端標(biāo)記可以用于細(xì)胞凋亡的定量研究。原位雜交技術(shù)和 PCR 技術(shù)結(jié)合用于檢測人瘤（HPV）九、單克隆抗體是 1975 年被描述的一種可產(chǎn)生無限量，并可其性質(zhì)的抗體技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵步驟在于淋巴細(xì)胞之間的融合，所以稱為“淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)”；由于雜交瘤經(jīng)過篩選可產(chǎn)生針對單一抗原決定簇抗體的細(xì)胞克隆，故稱為單克隆抗體技術(shù)。該技術(shù)的問世使得免疫學(xué)研究與實(shí)踐發(fā)生了性的改觀，同時還為生物學(xué)和學(xué)的許多領(lǐng)域提供了前所未有的研究工具。人們利用其可精確地識別出極為復(fù)雜的分子，測定出無法測定的物質(zhì)，識別出新的細(xì)胞群體，揭示了以往未曾了解的細(xì)胞分化途徑，為腫瘤、性疾病、自身免疫性疾病等的和治療創(chuàng)造出令人興奮的前景。十、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)取出某一種神經(jīng)組織，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下模擬在體生理環(huán)境，使之存活和生長，幷保持其結(jié)構(gòu)和功能。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)按培養(yǎng)前切割程度分為培養(yǎng)、組織快培養(yǎng)和細(xì)胞分離培養(yǎng)。1、培養(yǎng) （an culture ） 是切割最少型的培養(yǎng)。全或大片放在保溫的營養(yǎng)液中可保存數(shù)日。這類培養(yǎng)切斷了正常的，的營養(yǎng)交換