分光光度法(金)

1、 分光光度法和 722分光光度計的使用The Depart. of Biochemistry Shenyang Medical Institute 1.分光光度法的概念 利用物質(zhì)所特有的吸收光譜對物質(zhì)進行鑒別和定量測定的方法叫做。2.原理1)分光光度法的核心原理 比色分析法 待測物 + 呈色劑有色溶液以溶液呈色的深淺判斷其濃度2)分光光度法的核心定律 Lambert-Beer 定律當(dāng)單色光透過某種有色溶液時, 溶液的光密度(OD)與溶液的厚度和濃度成正比.OD = K L COD光密度值（Optic Density)K消光系數(shù)(為常數(shù))L溶液厚度C溶液濃度有色溶液I0IaI反射光分散光 其他因

2、素損失光則，I0=Ia+I+反射光分散光+ 其他因素損失光干擾因素空白管不含待測樣品，且具備其他一切光學(xué)因素經(jīng)空白管校正后：I0=Ia+I則，透光率T=II0經(jīng)空白管校正后，我們可以認為，透光率T的變化完全取決于待測樣品含量的多少。Lambert 定律：當(dāng)單色光透過某種有色溶液時，透過光強度隨液層厚度增加而指數(shù)地減弱。I = I010-KL則，透光率T =II0=I010-KLI0=10-KL則，光密度D =-T=-10-KLKL=Beer 定律：當(dāng)單色光透過某種有色溶液時，透過光強度隨溶液濃度增加而指數(shù)地減弱。I = I010-KC則，光密度D =KC則，Lambert-Beer 定律為：D

3、 = K L C3)應(yīng)用標(biāo)準曲線法標(biāo)準管法標(biāo)準曲線法特點：方便、快捷，適用于大批量樣品處理方法：a.標(biāo)準曲線繪制配制一系列與待測樣品溶質(zhì)相同的，濃度由小到大的標(biāo)準溶液，分別測OD值。CD0 b. 未知樣品濃度測定CD0DxCx標(biāo)準管法特點：相對準確，適用于少量樣品處理方法：設(shè)標(biāo)準溶液，濃度已知，分別測樣品和標(biāo)準溶液的OD值。D測 = K L C測D標(biāo)準 = K L C標(biāo)準C測=D測D標(biāo)準C標(biāo)準4)分光光度法的優(yōu)點靈敏：能測定出溶液中含量極少的物質(zhì)濃度準確：誤差小，與真實值非常接近快速：操作步驟簡單，較少時間內(nèi)得出結(jié)果簡便：無需從溶液中分離待測樣品5)分光光度法所使用的儀器 分光光度計 分光光度

4、計的基本結(jié)構(gòu)光源單色器吸收池受光器測量器檢測系統(tǒng)分光光度計的分類400760nm（可見光）200400nm（紫外光）76010,000nm（紅外光）6)分光光度計的使用方法接通電源，預(yù)熱30分鐘；裝樣；選擇波長；調(diào)零；測定；關(guān)閉電源，清洗比色杯。實驗一 用分光光度法測定血清蛋白含量實驗二 繪制吸收曲線實驗一 用分光光度法測定血清蛋白含量 【實驗?zāi)康摹?.掌握標(biāo)準曲線的制備方法和標(biāo)準管法的計算方法；2. 掌握雙縮脲法測定血清蛋白的原理和方法。 【實驗原理】 呈色反應(yīng)茚三酮反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)尿素被加熱至 180左右時，兩分子尿素縮合放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性條件下可與Cu2+結(jié)合生成復(fù)雜的

5、紫紅色化合物。此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。 【操作方法】 1. 標(biāo)準曲線制備： 取6支試管，標(biāo)注05號，按照下表加入試劑， 混勻，靜止30分鐘；標(biāo)準酪蛋白溶液 蒸餾水(ml)雙縮脲試劑(ml) 0 0 (ml) 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0試劑管號 于540nm波長下測定各管OD值； 以酪蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線； 2. 未知樣品濃度測定： 取5號管， 吸取1ml （1：10稀釋）血清待測樣, 用水補足至2ml，加入雙縮脲試劑4ml，混勻后與以上4管同時比色，從標(biāo)準曲線查出其蛋白質(zhì)

6、濃度，按稀釋倍數(shù)求出血清原液濃度。 3. 標(biāo)準管法： C測 = D測D標(biāo)C標(biāo) C原液=C測（2 + 4）10實驗二 繪制吸收曲線【實驗?zāi)康摹?掌握繪制吸收曲線的 原理和方法【實驗原理】 各種物質(zhì)都有其獨特的吸收光譜。不同物質(zhì)對單一色光的吸收程度不同；相同物質(zhì)對不同波長單色光的吸收程度也不同。如果利用不同波長的單色光透射待測物質(zhì)溶液時，會得到一系列相應(yīng)的OD值，那么：lD此光滑曲線即為該種物質(zhì)的吸收曲線。 吸收曲線有何意義？定性：測定待測物質(zhì)的吸收曲線，與已知曲線比對，推定該物質(zhì)是什么，既定性檢定；定量：定量測定已知物質(zhì)時，可選用該物質(zhì)的最大吸收峰波長，達到最佳測量效果?！静僮鞣椒ā块_機預(yù)熱30分鐘；裝樣：以蒸餾水為空白，用0.005%KMnO4 溶液加入另一比色杯；調(diào)不同波長測定OD值：在500570nm 區(qū)間測量，每隔10nm測量一次，其中 52054