流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定植物基因組大小

1、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定植物基因組大小流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)流式細(xì)胞術(shù)，即利用流式細(xì)胞計(jì)對(duì)處在快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞活生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等各學(xué)科的知識(shí)，它是一種自動(dòng)分析的技術(shù)。流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、流體力學(xué)為一體的一種新型高科技儀器。概念一 流式細(xì)胞術(shù)的基本知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)單細(xì)胞懸液或生物顆粒 分析速度高多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進(jìn)

2、的細(xì)胞定量分析技術(shù)高靈敏度無(wú)害分析和分選FACSCalibur 流式細(xì)胞分析儀EPICS XL 流式細(xì)胞分析儀國(guó)際兩大流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商： BD(Becton Dickinson)公司：FACSCalibur、FACSAria、FACS Vantage Diva等； BC(Beckman Coulter)公司：EPICS XL/-MCL、CytomicsTM FC500系列等。目前流式細(xì)胞儀可分為兩類(lèi)：臺(tái)式機(jī)和大型機(jī)特點(diǎn)：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定自動(dòng)化程度高操作簡(jiǎn)便使用壽命長(zhǎng)配備1-2根激光細(xì)胞分選速度慢， 主要用于細(xì)胞分析臨床型(BD,FACSCalibur臺(tái)式機(jī))大型機(jī)(BD,FACSAria科研型

3、)特點(diǎn)：分辨率高選配多種波長(zhǎng)和類(lèi)型激光器可把感興趣細(xì)胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)范圍細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞活性酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞功能細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/通路分析細(xì)胞間相互作用分子共定位與胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)熒光原位雜交基因表達(dá)分析細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期分析白細(xì)胞亞群分析 ImageStream成像流式細(xì)胞儀COPASTM 生物分選系統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)的最新突破分選微型模式生物 COPAS在線(xiàn)蟲(chóng)分選方面的應(yīng)用，就在Nature系列雜志上

4、發(fā)表了7篇以上的文獻(xiàn)模式動(dòng)植物研究、大體積細(xì)胞研究及藥物篩選等方面流式細(xì)胞儀的工作原理光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng)液流系統(tǒng) 流動(dòng)室 液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid液流系統(tǒng)：流動(dòng)室、液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱分選系統(tǒng)488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detectorFALS Sensor90L

5、S SensorLaser信號(hào)檢測(cè)-散色光FSC(前角散射光)它反應(yīng)細(xì)胞的相對(duì)大小和截面積的大小SSC (90度角散射光)代表細(xì)胞的顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化它反應(yīng)細(xì)胞的物理特性,根據(jù)前側(cè)向散射光，可以把不同類(lèi)型的細(xì)胞群加以區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)顯示類(lèi)型單參數(shù)直方圖（Histogram）X軸：代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)的強(qiáng)度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強(qiáng)度之間線(xiàn)性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號(hào)特征性細(xì)胞的頻率二維等高圖和密度圖 二維點(diǎn)圖Dot Plot便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不同的細(xì)胞群可以用不同的顏色標(biāo)記主要表達(dá)方式Pseudo 3D Plot3D Plot 利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等)與

6、細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量。二 植物C值分析原理 流式細(xì)胞儀計(jì)算測(cè)量DNA含量實(shí)際上是細(xì)胞周期的測(cè)量，由于細(xì)胞核G1期的DNA含量反應(yīng)一個(gè)細(xì)胞的倍性，因此常用DNA含量來(lái)估計(jì)細(xì)胞倍性，包括DNA的絕對(duì)含量或相對(duì)含量。 測(cè)量DNA的絕對(duì)含量時(shí)，須設(shè)一個(gè)已知DNA含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品作對(duì)照，來(lái)?yè)Q算出DNA的絕對(duì)含量。 樣品2C DNA含量=(樣品G0/G1峰均值)/ (標(biāo)準(zhǔn)G0/G1峰均值) 標(biāo)準(zhǔn)2C DNA含量(pg DNA)測(cè)量DNA的相對(duì)含量時(shí)，須設(shè)一已知倍性的同類(lèi)材料作照，換

7、算出待測(cè)樣品的DNA相對(duì)含量，進(jìn)行倍性分析。0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA content2N4Ncount變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV)：通常以G0/G1峰的寬度來(lái)反映,該指標(biāo)反映了儀器的分辨率或精確度。影響CV的因素主要包括兩方面：儀器因素（如鞘液的流速、光路、機(jī)器調(diào)試等）和樣本制備(如樣品中碎片含量、細(xì)胞團(tuán)塊、細(xì)胞活性和細(xì)胞濃度等)及染色過(guò)程對(duì)標(biāo)本的人為影響。優(yōu)化DNA分析條件就是指最大程度地減少這兩大因素帶來(lái)的變異。DNA指數(shù)(DNA index,DI)：DI指的是樣本G0/G1峰的平均道數(shù)與正常二倍體G0/G1峰的

8、平均道數(shù)之間的比值。DI為1 意味著二倍體(2c)。倍體(Ploidy)：原指染色體數(shù)目，流式中用來(lái)描述總的DNA含量。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的DNA含量但不除外染色體異常。DI為1.9-2.1 的細(xì)胞為四倍體(CV2.10 多倍體例：G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA AnalysisDNA content2N4NNormal Cell Cycle count0 200 400 600 8001000PI FluorescenceDNA AnalysisAneuploid peakDNA index 1.212N4N Loureiro et al.,2007. Fig 3復(fù)葉槭獼猴桃檸檬馬鞭草檸檬柿子無(wú)花果 植物組織細(xì)胞核 懸準(zhǔn)備 熒光染色上機(jī)檢測(cè)圖像數(shù)據(jù)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)C值主要流程 統(tǒng)計(jì)、分析ModFit試管苗、幼葉、愈傷等Galbraith(Galbraith et al. ,1983)LB01(Dolezel et al. ,1989)Otto(Otto ,1992);Dolezel and Gohde,1