細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)總結(jié)課楊曉明南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與神經(jīng)科學(xué)系細(xì)胞培養(yǎng)根本技術(shù)回憶細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感，這些物質(zhì)假設(shè)有殘留，會影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟清洗后的玻璃器皿干凈透明無油跡不殘留任何物質(zhì)浸泡：清水浸泡，可使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，生產(chǎn)及運(yùn)輸中，玻璃外表帶有大量干固的灰塵，外表呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等先用自來水刷洗，然后用5稀鹽酸液浸泡過夜以中和

2、堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿，常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求浸泡完全，不能留有氣泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿外表附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過度會損害器皿外表光澤度浸酸清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)；浸泡時器皿要充滿清潔液；浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時。清潔液，常用三種：強(qiáng)清潔液，次強(qiáng)清洗液，弱清潔液 配制時應(yīng)注意平安，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露局部配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為

3、棕紅色沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗，不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作，需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿蕩洗后倒凈，最后用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)，自來水沖洗，蒸餾水沖洗 2 - 3次，晾干備用塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，翻開包裝即可用，多為一次性物品必要時用2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，最后用自來水和蒸餾水

4、沖洗干凈，晾干備用消 毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染常見原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底由于在培養(yǎng)過程中每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染消毒滅菌方法物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺外表和不能使用其它方法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱高壓蒸氣滅菌法：121，20min干烤：160, 2 小時過濾：0.22m化學(xué)消毒滅菌法70%酒精：操作者皮膚，操作臺外表及無菌室內(nèi)壁面處理；1新潔爾滅：器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒抗生素培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染細(xì)胞培養(yǎng)常用試

5、劑細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純潔，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或超純水 一、水二、細(xì)胞培養(yǎng)基市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格廉價(jià)。缺點(diǎn)是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640、高糖DMEM、低糖DMEM、F12 等細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購置細(xì)胞株時咨詢。 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。

6、 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最正確培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。 制備1000 ml DMEM培養(yǎng)基 DMEM干粉培養(yǎng)基 10.0 g1包及要求的NaHCO3量3.7g 參加細(xì)胞培養(yǎng)用水600 ml 磁力攪拌至完全溶解 加細(xì)胞培養(yǎng)用水定容至 1000 ml 在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22 m孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成 100-200 ml/瓶，4保存?zhèn)溆?。同時取少量做無菌實(shí)驗(yàn)。 使用前添加小牛血清至終濃度為10%，添加青霉素和鏈霉素至終濃度分別為100 U

7、/ml和100 g/ml，即為細(xì)胞培養(yǎng)用液。血清熱滅活：56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。適用于細(xì)胞因子和免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)，否那么建議血清不要滅活。因?yàn)闊崽幚頃斐裳宄恋砦镲@著增多，還會影響血清的質(zhì)量。滅活后有時會嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm，5 分鐘去除，也可不用處理；顯微鏡下“小黑點(diǎn)：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會影響細(xì)胞生長。

8、但如果疑心血清質(zhì)量，那么應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清。平衡鹽液體組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的根本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分用于洗滌組織、細(xì)胞等D-Hanks 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)KCl0.40 gKH2PO40.06 gNaCl8.00 gNa2CO30.35 gNa2HPO40.048 gD-Glucose1.00 gPhenol Red0.01 gPBSPhosphate-Buffered Sallines KCl0.20g KH2PO4 0.20g NaCl8.00g Na2

9、HPO47H2O2.16gDPBSDulbeccos Phosphate-Buffered Sallines標(biāo)準(zhǔn)型CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.10 gKCl0.20 gKH2PO40.20 gMgCl26H2O0.10 gNaCl8.00 gNa2HPO47H2O2.16 g消化液別離組織和分散細(xì)胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液單獨(dú)或混合使用稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用平衡鹽溶液配制，常用濃度為0.25% 0.1%-0.5%，攪拌使溶解徹底，可置室溫4 小時，或冰箱攪拌振蕩過夜，用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右。進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中， -20保存

10、備用。胰蛋白酶溶液配制一、胰蛋白酶溶液主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散消化細(xì)胞時，參加血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA4Na 溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便；常用工作液濃度為0.02%；注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會影響細(xì)胞生長EDTA 溶液配制：用平衡鹽溶液配制，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4冰箱保存。pH 調(diào)整液NaHCO3 溶液常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4保存HEPES分子量238.31溶液羥乙基哌秦乙硫磺酸，一種弱酸，無細(xì)胞毒性主要作

11、用：防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，假設(shè)加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。HEPES配制使用終濃度一般為10-50 mmol/L常配成1M 儲存液：用20 ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4保存。使用時可向100 ml培養(yǎng)液中參加2ml HEPES儲存液，終濃度為20 mmol/L 谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加配制好的培養(yǎng)液含谷氨酰胺

12、在4放置2周以上時，要重新參加原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，臨用前參加培養(yǎng)液中；使用終濃度為1 4 mmol/L配制方法：一般配制為100倍儲存液，濃度200 mmol/L29.22 g/L谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂髴?yīng)加溫30，過濾除菌，分裝，-20保存；使用時向100 ml培養(yǎng)液中參加0.5 2 ml儲存液，終濃度為1 4 mmol/L 酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示橙紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫紅色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因?yàn)橐延幸恍┭芯空f明：酚紅能模擬類固醇激素尤其是雌激素樣作用

13、抗生素溶液抗生素使用種類與濃度： 工作濃度 儲存溫度 殺滅細(xì)菌 penicillin (青霉素) 100 U/ml -20 G(+) streptomycin (鏈霉素) 100 ug/ml -20 G(+) , G(-) gentamicin (慶大霉素) 50 ug/ml -20 G(+) , G(-), 支原體amphotericin B (兩性霉素B) 2.5 ug/ml -20 真菌nystatin (制霉菌素) 50 ug/ml -20 真菌器材和液體的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，160，2小時干烤滅菌后備用手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS

14、液15磅，121，20分鐘蒸氣滅菌培養(yǎng)液、小牛血清、消化液抽濾后備用無菌操作中的本卷須知在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射20-30 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟超凈臺鼓風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘操作時，小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，防止造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打 開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器翻開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用 在整個無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行冷凍保護(hù)劑目前常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為5-10。但有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑，如人白血

15、病細(xì)胞系HL-60。因?yàn)?，DMSO 能誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油glycerine，羥乙基淀粉(HES)等。特別注意細(xì)胞在冷凍過程中在-20冰箱內(nèi)放置時間一般不要超過1 小時，以防止冰晶過大而破壞細(xì)胞。也可跳過-20這一步驟直接放入-80冰箱中，但這樣做細(xì)胞存活率要低一些。DMSO 稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。DMSO 必須是細(xì)胞培養(yǎng)級別的。新買的DMSO 本身處于無菌狀態(tài)，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管或瓶中，4保存。防止反復(fù)凍融造成DMSO 裂解產(chǎn)生有害物質(zhì)。并可減少污染時機(jī)。如要過濾DMSO，必

16、須選用耐DMSO的尼龍濾膜。哺乳動物細(xì)胞冷凍保存冷凍保存要點(diǎn)慢凍。4 3060 min- 20 30 min - 80 1618 h或過夜液氮長期保存凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90，無污染。細(xì)胞濃度控制在：11075107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液10DMSO完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液(20血清根底培養(yǎng)液)10甘油完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液(20血清根底培養(yǎng)液)冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化不要超過3 分鐘；用1000轉(zhuǎn)離心23 分鐘，棄上清液；用510 ml 新鮮完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞；接種

17、細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3105/ml；24 小時后去除未貼壁的細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞培養(yǎng)是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。幼稚狀態(tài)的組織和細(xì)胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進(jìn)行原代培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)操作鼠胎組織細(xì)胞培養(yǎng)為例取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪

18、開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，解剖胎鼠，取出待培養(yǎng)組織。切割：用平衡鹽溶液將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，用平衡鹽溶液清洗，至組織塊發(fā)白為止。選擇選擇植塊法或者消化法培養(yǎng)。 1.植塊法培養(yǎng)：此時可直接將組織塊接種至培養(yǎng)容器底部，至貼壁4-6h后加少許培養(yǎng)基培養(yǎng)； 2.消化、接種培養(yǎng)：靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。參加0.25胰蛋白酶消化液5-10倍量，與組織塊混勻。室溫消化，注意觀察消化情況每隔幾分鐘搖動一下試管，靜置，加完全培養(yǎng)基終止消化，離心，去上清，參加適量細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹

19、打混勻，移入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層傳代細(xì)胞培養(yǎng)原理體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層集合以后，由于密度過大生存空間缺乏而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，沉著器中取出，以1:2或l:3的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞“一代指從細(xì)胞接種到別離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞可以倍增3-6次。傳代細(xì)胞培養(yǎng)操作將長成單層的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS輕洗細(xì)胞2 3次，可選用兩種方法消化參加少許消化液(以液面蓋住細(xì)胞為宜)，靜置35分鐘。參加適量消化液，使細(xì)胞全部浸沒在消化液中后即移去，用殘留在細(xì)胞間的酶消化。在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變圓，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液吸去，參加35ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液平均分至2 - 3個培養(yǎng)瓶中，并向每個瓶中分別補(bǔ)足適量培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果一般情況，傳代后的