雙波長差吸光度法后分光技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展前景

1、雙波長差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠景(精)雙波長差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠景(精)9/9雙波長差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠景(精)雙波長差吸光度法及后分光技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展遠景李雪志(本文1996年宣布成立在Lambertbeer定律基礎(chǔ)上的單波長分光光度分析技術(shù),應(yīng)用極為廣泛,但因為單波長法存在污濁試樣對光的散射和比色杯背景汲取等難以戰(zhàn)勝的弊端,它在高精度丈量中的應(yīng)用遇到必然的限制。為認識決污濁試樣對分光光度測定的干擾問題,美國的B.Chance于1951年制成了用振動鏡使兩束不同樣波長的單色光交替經(jīng)過待測溶液的雙波長分光光度計(DoubleWavelengthSpe

2、ctrophotometer從,而確立了雙波長分光光度法的基礎(chǔ)。跟著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,雙波長分光光度分析技術(shù)已日臻圓滿,與先進的后分光技術(shù)相聯(lián)合,在生化自動化分析中獲取了廣泛的應(yīng)用并顯示出了光明的發(fā)展遠景。雙波長分光光度法的原理雙波長分光光度法是在傳統(tǒng)分光光度法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,它的理論基礎(chǔ)是差吸光度和等汲取波長。它與傳統(tǒng)分光光度法的不同樣之處,在于它采納了兩個不同樣的波長即丈量波長(又叫主波長p,PrimaryWavelength和參比波長(又叫次波長s,SecondWavelength同時測定一個樣品溶液1,2,以戰(zhàn)勝單波長測定的弊端,提升了測定結(jié)果的精巧度和正確度。初期的雙波長分光光度計

3、在測準時,兩束不同樣波長的單色光經(jīng)斬光器(Chopper,一種用于雙波長分光光度計中使光束按必然周期反射,遮斷或經(jīng)過的裝置辦理后,以必然的時間間隔交替照耀1比色杯,經(jīng)待測溶液汲取后,再照到光電管上,產(chǎn)生兩個不同樣的吸光度,再將這兩個吸光度相減,就獲取了差吸光度A。依據(jù)Lamber-Beer定律,得:Ap=pLC+Ap(1As=sLC+As(2式中:A、pAs分別為待測溶液在主波長和次波優(yōu)點的吸光度、p分s別為待測溶液在主波長和次波優(yōu)點的摩爾吸光系數(shù):光徑:待測溶液的濃度Ap、As:分別為待測溶液在主波長和次波優(yōu)點的散射或背景汲取當p、s相差不太大時,由同一待測溶液產(chǎn)生的光散射吸光度和背景吸光度

4、大概相等,即Ap=As,將(1式-(2式得:A-pAs=A=(-psLC(3關(guān)于同一待測溶液來說,-p是s一常數(shù)K,在光徑L不變的狀況下,(3式可簡化為:A=KC(4(4式說明,待測溶液在p與s兩個波優(yōu)點測定的差吸光度A與試樣中待測物質(zhì)的濃度C成正比。這就是雙波長法賴以成立的定量公式1,3。雙波長差吸光度法擁有能夠戰(zhàn)勝溶液污濁的影響、共存組分汲取譜線疊加的攪亂,以及減少比色杯的光學(xué)不均一等優(yōu)點。它的差吸光度在2.5之內(nèi)時,線性范圍優(yōu)秀。2選擇雙波長的方法1,3雙波長差吸光度只管有好多優(yōu)點,但是怎樣正確選擇雙波長,則是應(yīng)用的重點。選擇雙波長常用的方法有三種:2.1依據(jù)待測溶液對吸光譜的汲取曲線,

5、選擇最大汲取峰對應(yīng)的波長為p吸,收曲線下端較為平坦的某一波長為s。2.2選待測溶液囁大汲取峰對應(yīng)的波長為p選,等汲取點的長為s。所謂等汲取點,是指關(guān)于某個波長,只管待測溶液的濃度不同樣,但對該波長的光的汲取均相等。等汲取點所對應(yīng)的波長叫做等汲取波長。關(guān)于汲取光譜擁有汲取峰的物質(zhì),同濃度下吸光度相等的兩個波長,也是等汲取波長。等汲取波長是雙波長法的理論基礎(chǔ)之一。應(yīng)用這一方法的必需條件是能正確地測定出等汲取點,不然將造成明顯的偏差。2.3選溶液最大汲取峰的波長為p,選顯色劑的最大汲取峰對應(yīng)的波長為s。該法又稱為雙波長增敏法,它的原理是:當向必然濃度的顯色劑溶液中加入待測物時,因為生成物質(zhì)濃度的增大

6、,生成物的吸光度也隨之增大,而顯色劑則因為不停耗費,其吸光度漸漸減小。假如以p為測定波長,s為參比波長時,測得的差汲取光度明顯是生成物吸光度與耗費的顯色劑的吸光度之和,進而提升了測定的敏捷度。由上述方法能夠看出,雙波長法選擇主波長的原理與單波長法同樣:均選擇待測溶液最大汲取峰對應(yīng)的波長,所不同樣的是雙波長法還應(yīng)依據(jù)不同樣條件選擇次波長。文件指出1,影響雙波長法測定精巧度的要素是:光輻射噪聲,電源不穩(wěn)和讀出噪聲,采納強光源能夠改良測定的精巧度。當試樣中含有攪亂物質(zhì)時,因為雙波長法減少了樣品的形式偏差,故測定的精巧度優(yōu)于單波長法。影響雙波長法正確度的要素是:由化學(xué)攪亂物惹起的偏差,但這類偏差要比單

7、波長法小得多;由物理攪亂惹起的偏差,但能夠經(jīng)過采納較小的雙波長差等方法來減少偏差,并且這類偏差自己就比單波長法更小;由儀器的非理想性如比色杯的性質(zhì)和地點,以及信號失調(diào)、狹縫過大和雜散光等惹起的偏差,此中尤此后者惹起的偏差為大,所以要求儀器的波長精度在高并且盡量減少雜散光。后分光技術(shù)及其在儀器上的應(yīng)用現(xiàn)代的全自動化分析儀因為多項目同時進行測定的需要,對分光光度計作了革命性的改造,并產(chǎn)生了后分光技術(shù)的見解,進而使雙波長分光光計光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)造變得較為簡單并且與單波長分光光度計有很大的差別。所謂后分光技術(shù)是相對傳統(tǒng)的分光光度計而言的。盡人皆知,光電比色法賴以成立的Lambert-Beer定律只適用于單

8、色光,單色光純度越高則測定結(jié)果的精巧度和正確度越好,假如用混淆光比色,則溶液的吸光度與液層厚度和溶液濃度間不可以比率關(guān)系。所以,傳統(tǒng)的分光光度計是以單色器(棱鏡或光柵對入射光進行分光,此后使特定波長的單色光經(jīng)過待測溶液進行比色測定,而現(xiàn)代生化分析儀上采納所謂后分光技術(shù)的分光光度計則是直接以光源燈所發(fā)出的混淆光透過待測溶液,經(jīng)溶液汲取后再用全息光柵(HolographicGrating,是當前最高等的分光器件,它既能夠簡化光路,又能夠減少雜散光,由它色散后投射到二極管矩陣上的光譜焦平面的波長精度在2nm之內(nèi)6對出射光進行分光,此后將純度很高的不同樣波長的單色光折射到光電二極管矩陣(Photodi

9、odeArray上,因為地點不同樣,矩陣上的每一個光電二極管只好接收某個特定波長的單色光。有人據(jù)此以為這各種類的分析儀但是用某幾個波長的濾光板,光不純,波長精度差,其實這是一種誤會。這類儀器在編制程序時(廠家或用戶已開初設(shè)定好某項試驗采納某個波長,儀器工作時在微機的控制下只接收所選波長的光電管上產(chǎn)生的電信號并將其轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的吸光度。當前的大部分生化分析儀的二極管矩陣都有7到10個光電二極管,包括了從340nm700nm范圍內(nèi)常用的710個測定波長4,5,有的分析儀(如美國雅培企業(yè)的EPX、SPECTRUM、CCX系列甚至多達16個波長。因為現(xiàn)代生化分析儀采納凹面全息光柵為后分光器件,進而撤消了

10、斬光器。使雙波長分光光度計的構(gòu)造變得相對簡單,并且更加重點的是,采納這類構(gòu)造的后分光技術(shù)使生化分析儀上多頂目同時測定變?yōu)楝F(xiàn)實。不然,假如仍按傳統(tǒng)分光光度計同樣以單色光進行比色測定,為適應(yīng)不同樣頂目在短時間內(nèi)用不同樣波長比色的需要,分光器件必然在幾秒甚至更短的時間內(nèi)屢次地改動反射鏡的地點,這關(guān)于機械來說是難以辦到的,即便制成也會易于破壞而缺少適用價值。后分光技術(shù)的成立使上述問題水到渠成,并且使雙波長分光光度法變得更加適用。雙波長法及后分光技術(shù)的現(xiàn)狀和遠景雙波長法自成立到現(xiàn)在已有四十多年的歷史,各樣通用型雙波長分光光度計在外國應(yīng)用已相當廣泛,但國產(chǎn)的分光光度計仍以單波長法為主。國內(nèi)有人依據(jù)雙波長法

11、的基本源理,敷衍了事,利用一般的單波長分光光度計(如721型成立雙波長測定法,即先用某一波長比色,記錄吸光度,再用另一波長比色后記錄另一吸光度,此后按雙波長法進行計算,獲取了較滿意的結(jié)果。最近幾年來,應(yīng)用雙波長法并聯(lián)合后分光技術(shù)的全自動生化分析儀已大批引進到國內(nèi),但除了廠家供給的雙波長數(shù)據(jù)外,好多人在儀器上自行編制試驗程序時對次波長選擇的重要性常常認識不足,擁有較大的任意性,由此造成試驗結(jié)果偏差還不知原由所在,所以有必需增強對雙波長法和后分光技術(shù)的認識。但能夠預(yù)示,跟著外國先進儀器的引進以及國產(chǎn)雙波長分光光度計漸漸進入市場,這一新技術(shù)必然為愈來愈多的人所認識和接受,并在醫(yī)學(xué)查驗領(lǐng)域獲取廣泛的應(yīng)用。參照文件王叔仁,等。雙波長分光光度法.濟南:山東科學(xué)技術(shù)第一版,1986.葉應(yīng)嫵,等主編.臨床實驗診療學(xué)(上.北京:人民衛(wèi)生第一版社,1989:137.黃尊波,等.雙波長分光光度法在醫(yī)學(xué)查驗上的應(yīng)用.中華醫(yī)學(xué)查驗雜志,1981,4(3:185.ServiceReferenceManualof550Ex