用于檢測(cè)和定量分析極性細(xì)胞代謝物的一種新穎的HILICLCMS方法

1、用于檢測(cè)和定量分析極性細(xì)胞代謝物的一種新穎的HILIC LC-MS方法來(lái)源：沃特世公司閱讀數(shù):61時(shí)間：2011-04-20引言復(fù)雜生物樣品通常包含大量可反映有機(jī)體代謝狀態(tài)的內(nèi)源性代謝物。特別是骨骼肌可根據(jù)其是快收縮肌 （白色肌肉，糖酵解型）還是慢收縮?。t色肌肉，氧化型）而表現(xiàn)出特征性的代謝組“指紋圖譜”。例如， 紅色肌肉應(yīng)顯示一種富含線粒體代謝物（如三羧酸循環(huán)）的代謝組指紋圖譜；而白色肌肉應(yīng)顯示富含糖 酵解代謝物的代謝組指紋圖譜，其線粒體代謝物的濃度大大低于紅色肌肉。雖然很多這類(lèi)代謝物可具有 較強(qiáng)的極性，但這些樣本通常使用反相液相色譜-質(zhì)譜（RP-LC-MS）進(jìn)行分析，由此而來(lái)的多是較差的

2、 保留。在本研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)和定量強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的新穎LC-MS方法。本研究采用 了基于亞2微米顆粒BEH酰胺柱的親水作用液相色譜（HILIC），并聯(lián)用了雜化四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 和三重四極桿質(zhì)譜。方法這些試驗(yàn)借助聯(lián)用了沃特世SynaptTM HDMSTM、沃特世Synapt G2 HDMS和Xevo TQ的一臺(tái)UPLC系 統(tǒng)而進(jìn)行：液相色譜條件（1）:使用堿性流動(dòng)相液相色譜系統(tǒng)：沃特世ACQUITY UPLC系色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1x100mm，1.7m柱溫：45 C流速：500口L/分鐘堿性流動(dòng)相A：乙腈/水，95/5 （v/

3、v），10mM醋酸銨，pH=9.0堿性流動(dòng)相B：乙腈/水，50/50 （v/v），10mM醋酸銨，pH=9.0梯度（采用堿性流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)）：線性梯度，先用2% B - 85% B洗脫8分鐘，然后在98% B的水平 下保持2分鐘，接著返回到2% B的水平進(jìn)行再平衡（5分鐘）進(jìn)樣量：5-20隊(duì)液相色譜條件（2）:使用酸性流動(dòng)相液相色譜系統(tǒng)：沃特世ACQUITY UPLC系統(tǒng)色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1x100mm，1.7m柱溫：40 C流速：600口L/分鐘酸性流動(dòng)相A：乙腈/水，95/5 （v/v），10mM醋酸銨，pH=3.0酸性流動(dòng)相B：水，10

4、mM醋酸銨，pH=3.0一梯度：先用5% B - 30% B洗脫5分鐘，在第5.5min時(shí)升至60% B并保持7分鐘，接著返回到5% B 的水平進(jìn)行再平衡（5分鐘）進(jìn)樣量：20|jL滿(mǎn)定量環(huán)質(zhì)譜分析Synapt HDMS 和 Synapt G2 HDMS該質(zhì)譜儀在正離子MSE模式下運(yùn)行。所用的毛細(xì)管電壓為3.0kV，源溫度和去溶劑化溫度分別被設(shè)定為 120C和 400Co在MSE采集模式下，儀器交替在低、高碰撞能量狀態(tài)下進(jìn)行交替掃描。這樣可在一次分析內(nèi)同時(shí)收集所 有分析物的母離子和碎片離子的信息，消除了諸如DDA等其它常規(guī)方法所帶來(lái)的采樣偏差；在常規(guī)方法 中，特定的m/z必須在碎片化前被分離出

5、來(lái)。Xevo-TQ 質(zhì)譜Xevo TQ可同時(shí)在正離子和負(fù)離子模式下運(yùn)行。毛細(xì)管電壓為3.0kV，源溫度和去溶劑化溫度分別被設(shè) 定為150C和650C。去溶劑化氣體流速被設(shè)定為1200L/小時(shí)，碰撞氣體（氬）的流速為0.18mL/分 鐘（4x10-3毫巴）。MS1/MS2分辨率被設(shè)置為單位質(zhì)量（0.75Da FWHM）。組織提取物的樣品制備紅色的比目魚(yú)?。⊿）用來(lái)與白色的腓腸?。℅）進(jìn)行比較，肌肉從禁食一整夜的BALB/c小鼠中切下并 進(jìn)行了急速冷凍。代謝物通過(guò)組織均質(zhì)化的方法在1:1的甲醇：水混合溶劑中進(jìn)行萃取，脂質(zhì)通過(guò)將氯 仿以1:1的比例添加至甲醇/水萃取液中而得到去除。去脂質(zhì)后的組織萃取

6、樣本分別用400此和4000此 的90:10乙腈：水混合溶劑進(jìn)行揮干復(fù)溶。由于某些組分的含量高于定量上限，因此也對(duì)每份樣本再稀 釋10倍進(jìn)行了分析。結(jié)果和討論1.通過(guò)聯(lián)用Synapt HDMS的UPLC進(jìn)行HILIC LC-MS方法開(kāi)發(fā)圖1. 108種標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的總離子色譜圖，其中包括氨基酸帥衲4堿基及其磷酸鹽、輔 酶A、B族維生素、有機(jī)酸等。圖1給出了 108種標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的總離子色譜圖（TIC），其中包括氨基酸、DNA/RNA堿基及其磷酸鹽、輔酶A、B族維生素、有機(jī)酸等。此項(xiàng)試驗(yàn)通過(guò)聯(lián)用沃特世Synapt HDMS （正離子MSE模式下）的沃特世UPLC【液相色譜條件（1

7、）】而進(jìn)行。SS2.單 f 會(huì)礎(chǔ)心子色備圖和麗口國(guó)專(zhuān)口內(nèi)2.使用UPLC / Xevo-TQ聯(lián)用儀器對(duì)HILIC LC-MS方法開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞莘取物進(jìn)行定量分析在UPLC優(yōu)化過(guò)程中進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)品分析表明使用酸性pH的流動(dòng)相緩沖液可提高對(duì)氨基酸 和有機(jī)酸的分辨率、信噪比和峰對(duì)稱(chēng)性。圖3比較了對(duì)一種包含約2口g/mL L-賴(lài)氨酸的純 氨基酸溶液所得出的兩幅MRM色譜圖。靠上的色譜圖通過(guò)使用堿性流動(dòng)相（液相色譜條 件1）所進(jìn)行的分離而得出，而靠下的色譜圖則采用酸性流動(dòng)相（液相色譜條件2）。圖3.比較不同pH下，包含約2“g仞LL-賴(lài)氨酸溶液的兩幅MAM色譜圖圖4.液相色譜條件但）得出的MRM色譜圖示

8、例圖4將酸性流動(dòng)相（液相色譜條件（2）下1600ng/mL校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（上圖）和樣本H-S （0090）的MRM色譜圖進(jìn)行了疊加。在此條件下，我們成功分離并定量分析了 28種化合物，其中包括氨基酸、有機(jī)酸和磷酸鹽（圖6）。圖5. TargetLynx給出的ADP電子報(bào)告示例43種化合物的定量分析（既包括酸性也包括堿性條件）使用TargetLynxTM進(jìn)行。對(duì)于每種化合物，均 生成了相應(yīng)的電子報(bào)告；計(jì)算結(jié)果通過(guò)線性回歸進(jìn)行確定。圖5是腺苷二磷酸（ADP，在三羧酸循環(huán)中 特別重要）的一個(gè)報(bào)告示例。jit-a圖6.使用堿性（左表）和酸性（右表）流動(dòng)相在S和H-G組織樣本中所檢出化合物的濃度計(jì)算結(jié)果 總

9、合對(duì)在堿性和酸性流動(dòng)相分離中所檢出的H-S和H-G組織樣本中的每種化合物均計(jì)算了分析物濃度。通過(guò) 比較紅色比目魚(yú)?。⊿）和腓腸肌（G）組織樣本中的代謝物濃度證實(shí)了在其相對(duì)濃度方面存在顯著差異。3.通過(guò)聯(lián)用Synapt G2的UPLC對(duì)HILIC LC-MS方法的標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞萃取物進(jìn)行定量分析最近開(kāi)發(fā)的用于Synapt G2的QuanTof技術(shù)以及MSE數(shù)據(jù)采集技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了一種通用型 UPLC-MS方法的開(kāi)發(fā)；這種方法可在一次運(yùn)行分析得到提供所有物質(zhì)的定量和定性信息，既包括母離 子信息也包括產(chǎn)物離子的信息。對(duì)于此項(xiàng)測(cè)定而言，系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及H-S和H-G樣本的數(shù)據(jù)都進(jìn)行 了采集（圖7），所

10、有的數(shù)據(jù)處理工作在采集完成后進(jìn)行。圖7.全掃描色譜圖比較。通過(guò)PLC-S皿apf G2獲取的S和G細(xì)胞萃取物的數(shù)據(jù)。圖8.目標(biāo)化合物的鑒定和定量結(jié)果首先，自動(dòng)篩選細(xì)胞萃取物中是否存在目標(biāo)化合物。離子的鑒定和確認(rèn)通過(guò)一個(gè)單一處理步驟使用 PositveTM軟件包得出母離子和子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量（2mDa窗口）而實(shí)現(xiàn)（圖8）。該數(shù)據(jù)表明與Xevo TQ分析結(jié)果具有良好的一致性。圖8給出了一個(gè)示例，化合物L(fēng)-脯氨酸在細(xì)胞萃取 物中被明確鑒別出來(lái)，并在4個(gè)數(shù)量級(jí)中表現(xiàn)出線性的動(dòng)態(tài)范圍響應(yīng)，RMS質(zhì)量誤差為0.57mDa。結(jié)論使用新型BEH Amide酰胺柱可開(kāi)發(fā)出一種用于分離極性組織細(xì)胞代謝物的HILIC LC-MS方法，總運(yùn)行時(shí) 間不到15分鐘。同時(shí)采用Xevo TQ和Synapt G2 HDMS對(duì)紅色和白色的肌肉組織莘取物進(jìn)行定量分析，可明顯區(qū)分出其主 要代謝物（比如AMP、A