乳酸菌對沙棘汁中酚酸及揮發(fā)性化合物的影響研究

1、乳酸菌對沙棘汁中酚酸及揮發(fā)性化合物的影響研究沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木，廣泛種植于我國西北地區(qū)。沙棘漿果富含大量天然營養(yǎng)物質(zhì)1，沙棘果中富含酚類化合物、維生素、脂肪酸及植物甾醇等天然營養(yǎng)成分2。沙棘果還擁有一定的醫(yī)療潛力，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等特性3；并且對于一些慢性疾病有著積極作用，例如高脂血癥，2型糖尿病和心血管疾病4。然而沙棘果在采摘運(yùn)輸過程中容易受到機(jī)械損傷，將其加工成果汁、濃縮汁等產(chǎn)品不僅可以方便運(yùn)輸，還可以在一定程度上保留沙棘果中的營養(yǎng)成分。目前市場上的沙棘果汁產(chǎn)品的加工方式以添加蔗糖、甜味劑等簡單的糖酸比調(diào)節(jié)為主。產(chǎn)品附加值

2、不高，且對消費(fèi)者吸引力不強(qiáng)5。乳酸發(fā)酵被認(rèn)為是一種保持并提高果蔬營養(yǎng)價值及感官特性的加工方法6。未經(jīng)加工的沙棘果汁pH為22.9，這是由于沙棘汁中含有大量以蘋果酸為主的有機(jī)酸7。而乳酸菌通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵可以將口感苦澀、具有刺激性酸味的蘋果酸轉(zhuǎn)化成口感柔和的乳酸8。此外，乳酸發(fā)酵還能提高果蔬汁的營養(yǎng)價值，F(xiàn)ENG等9研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可以顯著提高枸杞汁的抗氧化能力，并且類黃酮、酚類等化合物也有所增加。ZHANG等10研究發(fā)現(xiàn)，通過植物乳桿菌發(fā)酵的藍(lán)莓汁酚類物質(zhì)總量增加了43.42%，花青素含量提高了15.38%，且抗氧化能力也有所提高。PENG等11發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵對于蘋果濁汁的香氣成分也有

3、一定的改善。因此本研究選用嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌復(fù)配對沙棘果汁進(jìn)行發(fā)酵，通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry, LC-ESI-MS)、HPLC、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)等方法對發(fā)酵前后的酚酸、有機(jī)酸和揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測，同時對發(fā)酵前后的抗氧化性進(jìn)行測定并與酚酸進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為沙棘乳酸菌產(chǎn)

4、品的研制提供參考。1 材料與方法1.1 主要試劑、儀器和設(shè)備植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌，上海仙農(nóng)生物科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸、冰乙酸、無水醋酸鈉、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine, TPTZ)、DPPH、ABTS(均為分析純)，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；MRS固體培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)有限公司；有機(jī)酸及酚酸標(biāo)品(均為色譜級)，上海源葉生物科技有限公司；磷酸、甲醇、甲酸、乙腈、2-辛醇(均為色譜級)，上海麥克林生化科技有限公司。LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；8890-7000D氣象色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫

5、科技有限公司；T9S紫外可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WSC-S色差儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Vanquish超高效液相系統(tǒng)、Q exactive高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司。1.2 發(fā)酵沙棘汁的制備沙棘購自新疆石河子，儲存于(40.5) 的冷庫中。挑選成熟完整的沙棘用去離子水清洗以除去灰塵和表面雜質(zhì)。將沙棘果與蒸餾水按料液比11(gmL)的比例打漿，然后使用40目篩網(wǎng)過濾雜質(zhì)。為了給乳酸菌提供生長所用碳源和適宜的酸堿度，使用白砂糖和無水Na2CO3(食品級)將可溶性固形物含量和pH分別調(diào)整為10.0和6.0，之后在75 的水浴中巴氏殺菌20 min。將沙棘汁冷卻至

6、25 ，將混合乳酸菌粉m(嗜酸乳桿菌)m(植物乳桿菌)=11與無菌水以150(gmL)的比例混合，此時活菌數(shù)為1010CFU/mL，接著從中吸取0.07% (體積分?jǐn)?shù))至沙棘汁中，在37 培養(yǎng)48 h。作為對照，將未接種菌粉的沙棘汁置于相同的條件下48 h。實(shí)驗(yàn)組和對照組都為3次重復(fù)。1.3 理化指標(biāo)的測定可溶性糖參照NY/T 27422022水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法測定；總酸參照GB 124562022食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定pH電位滴定法測定；有機(jī)酸檢測方法參照GB 5009.1572022食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品有機(jī)酸的規(guī)定對酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乳

7、酸進(jìn)行測定。島津高效液相色譜系統(tǒng)，檢測器SPD-20A，色譜柱選用CAPECELL PAK MG S5 C18柱，4.6 mm250 mm,5 m。使用色差儀對沙棘汁的色差進(jìn)行測定，使用白板和黑板將色差儀進(jìn)行預(yù)熱校準(zhǔn)，隨后稱取5 mL的樣品進(jìn)行測定分析，試驗(yàn)重復(fù)3次，最終結(jié)果取平均值12。1.4 抗氧化能力的測定總抗氧化能力用鐵離子還原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)法13測定；參照文獻(xiàn)14的方法測定DPPH自由基清除活性；ABTS陽離子自由基清除活性參照文獻(xiàn)15的方法稍加修改后測定。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.5 酚酸的測定16采用LC-ESI-

8、MS分析方法對樣品中酚酸進(jìn)行定性定量檢測，具體分析條件和分析方法如下：色譜條件：色譜系統(tǒng)采用超高效液相系統(tǒng)(Vanquish，Thermo，USA)，根據(jù)化合物的性質(zhì)，采用Waters HSS T3(100 mm2.1 mm，1.8 m)液相色譜柱，進(jìn)樣量2 L，柱溫40 。流動相A(0.1%甲酸-乙腈)，流動相B(0.1%甲酸-水)。梯度洗脫(02 min，A相10%，B相90%；28 min，A相60%，B相40%；812 min，A相10%，B相90%)。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜系統(tǒng)采用美國Thermo公司的Q exactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，配有電噴霧(ESI)離子源和Xcalibur工作站

9、。采用電噴霧離子源(ESI)，分析物在負(fù)離子同時掃描下以單離子檢測(SIM)模式進(jìn)行分析，該模式可以大大提高靈敏度。優(yōu)化的質(zhì)譜分析條件如下：鞘氣40；輔助氣10；離子噴霧電壓+3 000 V；溫度 350 ；離子傳輸管溫度320 。1.6 HS-SPME-GC-MS揮發(fā)性化合物分析17向20 mL頂空瓶中加入1 g NaCl，然后加入5 mL樣本和10 L 2-辛醇(1 000 g/L)。為吸附揮發(fā)性化合物，將萃取頭插入40 頂空瓶中40 min。然后，使用帶有HP-innowax (30 m0.25 mm0.25 m)毛細(xì)管柱的GC-MS (Agilent 8890-7000D)分析揮發(fā)性化

10、合物。起始溫度40 ，保持2 min，然后以3 /min升至85 ，再以1 /min升至105 ，然后以3 /min升至180 ，最后以10 /min升至230 ，保持5 min。與NIST2022和Wiley 8.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，通過質(zhì)譜鑒定了樣本中的揮發(fā)性化合物，以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)測定各化合物的量，不考慮揮發(fā)性化合物的回收率和響應(yīng)因素，各種揮發(fā)性化合物定量分析如公式(1)所示：揮發(fā)性化合物提取量/(gL-1)=樣品質(zhì)量(1)1.7 數(shù)據(jù)處理使用Origin 2022b及R軟件進(jìn)行作圖，使用SPSS 25進(jìn)行方差分析，P0.05表明差異顯著。2 結(jié)果與討論2.1 發(fā)酵前后理化指標(biāo)的變化從表1

11、可看出，乳酸菌在沙棘果汁中生長良好，由可溶性糖、總酸、活菌數(shù)指標(biāo)的變化可知復(fù)配乳酸菌可以很好地利用果汁中的碳源，對可溶性糖的利用率達(dá)到了42.4%，而可滴定酸含量增加了92%。據(jù)報道，乳酸菌對碳源的利用主要有兩條途徑：通過糖酵解(EMP)途徑產(chǎn)生乳酸，即乳酸菌在無氧條件下將碳源分解為丙酮酸，進(jìn)而將丙酮酸還原為乳酸18；另一方面乳酸菌還可以通過蘋果酸-乳酸(malolactic fermentation,MLF)發(fā)酵途徑將蘋果酸脫羧形成乳酸，圖1為有機(jī)酸測定的總離子流色譜圖，對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后得到有機(jī)酸的含量如表1所示。沙棘汁中的蘋果酸含量為6.45 g/L，發(fā)酵結(jié)束時的蘋果酸含量為2.34 g/

12、L，所以乳酸菌在沙棘汁中有良好的蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化能力，通過蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化可以將口感酸澀的蘋果酸轉(zhuǎn)化為柔和的乳酸，豐富了飲料的口感19。酒石酸則是水果中一種常見的有機(jī)酸，具有強(qiáng)烈的酸味，在乳酸發(fā)酵過程中通過酒石酸脫水酶的作用可以將酒石酸轉(zhuǎn)化為乳酸和CO2，也可以在一定程度上降低果汁中酸澀的口感。檸檬酸含量在發(fā)酵前后則無顯著差異(P0.05)。從理化指標(biāo)可以看出，乳酸菌可以很好地改善沙棘汁的口感，并改變沙棘汁中的有機(jī)酸組成，同時活菌數(shù)也高于輕工標(biāo)準(zhǔn)QB/T 53562022果蔬發(fā)酵汁中規(guī)定的乳酸菌總數(shù)需1105CFU/mL的要求。為了進(jìn)一步研究復(fù)配乳酸菌發(fā)酵對沙棘汁的影響，同時也對發(fā)酵前后的色差

13、值進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示發(fā)酵前后L*、a*及b*值有顯著差異，L*值的變化可能是因?yàn)槿樗峋脑鲋?，?dǎo)致飲料的濁度增加從而引起L*值的下降，a*、b*在發(fā)酵后有明顯改變，這可能是因?yàn)槿樗峋拇x作用將大分子的酚類物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，從而改變了飲料的顏色20。圖1 有機(jī)酸的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of organic acids表1 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice注：同

14、列不同小寫字母表示差異(P0.05);ND-未檢出(下同)2.2 抗氧化能力的測定水果是抗氧化劑的良好天然食物來源之一，抗氧化活性可以作為評價水果產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一21。對乳酸菌發(fā)酵前后沙棘汁的抗氧化能力、自由基清除能力進(jìn)行了檢測，總抗氧化能力結(jié)果如表2所示，發(fā)酵沙棘汁(6.15 mmol/L)顯著(P0.05)高于沙棘汁(5.56 mmol/L)，發(fā)酵可顯著增強(qiáng)沙棘汁抗氧化能力。DPPH自由基清除活性試驗(yàn)表明，相比于沙棘汁，發(fā)酵沙棘汁(82.2%)的DPPH自由基的清除能力提高了23.98%。ABTS陽離子自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳酸菌發(fā)酵沙棘汁為87.65%和沙棘汁為75.03%。相比未發(fā)酵

15、沙棘汁，發(fā)酵后的沙棘汁ABTS陽離子自由基清除能力提高了16.8%。有研究表明，乳酸菌飲料抗氧化能力的提高可歸因于酚類物質(zhì)的變化22。為此，在后續(xù)的研究中對酚酸進(jìn)行了檢測。表2 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacity of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice2.3 發(fā)酵前后的酚酸檢測結(jié)果酚酸測定的總離子流色譜圖如圖2所示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到酚酸的含量，從圖3可以看出，沙棘汁中主要的酚酸為：阿魏酸(36.17%)、香草酸(15.34%)、咖啡酸(12.95%)、沒食子酸(12.

16、79%)，而乳酸菌發(fā)酵沙棘汁中主要的酚酸分別為：阿魏酸(32.83%)、沒食子酸(30.9%)、咖啡酸(11.25%)。圖2 酚酸的總粒子流色譜圖Fig.2 Total ion flow chromatogram of phenolic acids發(fā)酵后沒食子酸和阿魏酸的含量都有顯著增加(P0.05)，其原因可能是在發(fā)酵過程中pH下降形成的酸性環(huán)境減緩了酚酸的氧化。乳酸菌水解酶也可以將復(fù)雜的多酚如植物細(xì)胞壁的多酚化合物通過水解形成小分子化合物的方式釋放出來，從而增加多酚物質(zhì)的含量23。圖3 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁中酚酸含量的比較Fig.3 Comparison of phenolic acid c

17、ontent between sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice 注：不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)對酚酸與抗氧化性和色度進(jìn)行了皮爾遜相關(guān)性分析，如圖4所示，其中沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸及總酚酸與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的清除能力呈顯著正相關(guān)(P0.05)，而與FRAP抗氧化能力呈顯著正相關(guān)的酚酸為沒食子酸、阿魏酸、肉桂酸及總酚酸。沒食子酸和阿魏酸是一種常見的抗氧化劑，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等病理作用，對心血管疾病也有一定的治療作用24。乳酸菌發(fā)酵對于咖啡酸的含量并沒有顯著影響。香草酸、丁香

18、酸、對羥基苯甲酸，水楊酸在發(fā)酵之后略有減少。這可能是由于乳酸菌代謝使得不穩(wěn)定的酚酸轉(zhuǎn)化成了其他物質(zhì)。而發(fā)酵后沒食子酸及阿魏酸顯著增加(其中沒食子酸較發(fā)酵前增加了183%)，這可能是發(fā)酵后DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP抗氧化能力增加的原因之一。而對色度與酚酸的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，所有酚酸均與L*、a*、b*的變化呈顯著(P0.05)相關(guān)，這說明發(fā)酵之后酚酸成分的變化是造成顏色改變的重要原因之一。圖4 酚酸與抗氧化能力及色度的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of phenolic acid with antioxidant activity

19、and chromaticity2.4 發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物測定結(jié)果本研究共鑒定出了41種揮發(fā)性化合物(其中沙棘汁32種，發(fā)酵沙棘汁36種)，包括29種酯類化合物、5種醛類化合物、3種醇類化合物、3種酮類化合物及1種酸類化合物。從圖5可知，3組平行試驗(yàn)之間差異不大，這說明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好，同時發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物成分差異較大且發(fā)酵后揮發(fā)性化合物濃度顯著增加。為了研究發(fā)酵前后香氣成分的差異，通過對化合物的濃度與嗅聞閾值的比值對香氣活度值(odor activity value,OAV)進(jìn)行計(jì)算，OAV1的揮發(fā)性化合物被認(rèn)為對風(fēng)味具有貢獻(xiàn)，發(fā)酵前的沙棘汁中共2種OAV1的化合物，分別為：異戊酸乙酯

20、(類似蘋果、香蕉的香氣和酸甜氣味，OAV=23.38)、正己酸乙酯(水果香氣，OAV=4.30)，發(fā)酵后的沙棘汁中共5種OAV值1的化合物，它們分別為：丁酸乙酯(菠蘿香味，OAV=7.13)、異戊酸乙酯(OAV=29.08)、正己酸乙酯(OAV=6.19)、異戊酸異戊酯(水果香氣，OAV=1.23)、月桂酸乙酯(花生香氣，OAV=1.20)。乳酸菌發(fā)酵一定程度上改善了沙棘汁的風(fēng)味；為了進(jìn)一步分析發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物的變化，以揮發(fā)性化合物濃度為指標(biāo)，使用正交偏最小二乘法判別分析(discriminant analysis of orthogonal partial least squares, OPLS-DA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理25。圖5 沙棘汁和發(fā)酵沙棘汁的揮發(fā)性化合物含量熱圖Fig.5 Heat map of volatile compounds content in sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juic