食管內(nèi)臟高敏感性動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)

1、食管內(nèi)臟高敏感性動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)臟高敏感性；-fs；免疫組織化學(xué)；食管酸灌注；卵清蛋白基金工程國(guó)家自然科學(xué)基金資助工程30700362Establishandevaluatinftheratdelfesphagealviseralhypersensitivity慢性食管內(nèi)臟高敏感性可能是某一亞類(lèi)的非腐敗性反流病(NERD)發(fā)生的最重要病理生理特征，是這類(lèi)患者病癥產(chǎn)生的根底和病癥多樣化的原因1-2。目前，尚不清楚中樞神經(jīng)系統(tǒng)(NS)中哪些核團(tuán)及環(huán)路參與了食管內(nèi)臟高敏感性的應(yīng)答和調(diào)節(jié)，亦不明了在內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下哪些構(gòu)造對(duì)食管化學(xué)刺激反響敏銳，且在人體開(kāi)展NS內(nèi)形態(tài)學(xué)-功能的定位研究

2、非常困難。因此，采用有效的動(dòng)物模型來(lái)研究?jī)?nèi)臟敏感性改變的中樞敏化機(jī)制有著非常重要的意義。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年安康SD大鼠29只，雌雄不限，體質(zhì)量225285g，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將SD大鼠隨機(jī)分為組，A組：空白對(duì)照組6只；組：食管酸灌注組8只；組：VA致敏組7只；組：VA及食管酸灌注組8只。1.2方法1.2.1食管酸灌注的方法在實(shí)驗(yàn)的第14天，對(duì)組、D組動(dòng)物進(jìn)展食管酸灌注。麻醉動(dòng)物平臥位固定，頭部抬高2030，切開(kāi)腹壁和胃壁，將一引流管放置在賁門(mén)處以搜集從食管滴注的液體。把一單腔灌流管經(jīng)口放置于食管內(nèi)，導(dǎo)管開(kāi)口位于食管和胃交界處上23，固定導(dǎo)管，另一端與持續(xù)灌注泵相連。使

3、用0.1l/L鹽酸滴注，滴注液溫度保持37，速度10L/h，共50in。1.2.2腦組織切片的制備食管酸灌注后30in深度麻醉動(dòng)物后立即開(kāi)胸，經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管并加壓灌注200L生理鹽水沖洗全身血液，隨后用預(yù)冷的4含4%多聚甲醛的0.1l/L磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)500L加壓灌注固定1h。然后取脊髓和全腦組織置于一樣固定液中，在4條件下固定1820h，再移至含20蔗糖的0.1l/LPB溶液中浸泡過(guò)夜至下沉4。用恒冷箱冰凍切片機(jī)-20行連續(xù)冠狀切片，片厚40，隔5取2，切片貼于經(jīng)APES處理的載玻片上備用。1.2.3Fs表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色用含0.01l/L正常小牛血清、0.5%

4、TritnX的PBS液室溫下孵育2h；滴加兔多克隆抗-fs抗體稀釋液12000，ngen公司，4孵育48；滴加二抗，SuperPiTure即用型二步法檢測(cè)試劑盒由上海藍(lán)創(chuàng)生物公司提供在37孵育1015in；DAB/H22法呈色；最后進(jìn)展常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片、光鏡觀察。1.2.4Fs陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法用日本lypusBX-50光學(xué)顯微鏡觀察，然后用江蘇捷達(dá)科技提供的顯微圖像分析系統(tǒng)處理并計(jì)算出各腦區(qū)及神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)Fs蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的總和。1.2.5數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析比擬各組間數(shù)值差異顯著性，P0.05有顯著性差異。2結(jié)果各組NS內(nèi)FLI神經(jīng)元計(jì)數(shù)，從表1可看

5、出：B組大鼠的中央杏仁核、KF核群、下丘腦室旁核、下丘腦視上核、丘腦室旁核、臂旁核、疑核、三叉旁核、孤束核中央亞核和最后區(qū)等核團(tuán)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比擬有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見(jiàn)表1，P0.05，而額頂葉皮質(zhì)那么僅有少數(shù)FLI顆粒。組在額葉皮質(zhì)、區(qū)、扣帶回皮質(zhì)、區(qū)，及中央杏仁核、下丘腦室旁核、中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)、中尾段延髓的孤束核內(nèi)側(cè)亞核背側(cè)和最后區(qū)內(nèi)有中等密度的Fs陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)，且與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組大鼠額頂葉皮質(zhì)(圖1)、島葉、扣帶回、中央杏仁核、KF核群、疑核、臂旁核、下丘腦室旁核、丘腦室旁核、三叉旁核、孤束核、最后區(qū)、延髓網(wǎng)狀核等核團(tuán)(圖2)FLI神經(jīng)元的數(shù)目較單純的食管酸灌注組

6、和VA致敏組顯著增加P0.05。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.表1四組大鼠不同腦區(qū)和核團(tuán)Fs陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量比擬略*：與A組比擬，P0.05；#：與A組比擬，P0.05；:B組和組比擬，P0.01a:40;b:200;:棕褐色顆粒為核染色陽(yáng)性細(xì)胞圖1VA致敏結(jié)合食管酸灌注大鼠前額葉皮質(zhì)Fs表達(dá)略a:40;b:100;:棕褐色顆粒為核染色陽(yáng)性細(xì)胞圖2VA致敏結(jié)合食管酸灌注大鼠在延髓內(nèi)臟帶內(nèi)有Fs密集分布略3討論本研究采用預(yù)先腹腔注射卵清蛋白根底致敏后再進(jìn)展食管酸灌注的方法來(lái)制備食管內(nèi)臟高敏感性大鼠模型，并采用免疫組織化學(xué)方法評(píng)估模型可靠性。-fs原癌基因及其編碼的相關(guān)蛋白可作為研究神經(jīng)傳導(dǎo)通路或腦的功能

7、活動(dòng)的一個(gè)有意義的標(biāo)志物，亦可作為中樞神經(jīng)對(duì)傷害性刺激反響的疼痛標(biāo)志物，可用來(lái)判斷、追蹤傷害性刺激信號(hào)的傳導(dǎo)通路，其表達(dá)部位常常是與傷害性信息傳遞、中繼或整合有關(guān)的區(qū)域。-fs還可以作為第三信使承受細(xì)胞外刺激的短程信息，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能變化，因此-fs在神經(jīng)系統(tǒng)可塑性方面扮演著重要的角色3-4。近年來(lái)在神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)定位和功能活動(dòng)相結(jié)合的研究中得到了廣泛應(yīng)用，已在內(nèi)臟痛覺(jué)過(guò)敏的神經(jīng)機(jī)制的研究中得到應(yīng)用5-7。Fs蛋白形態(tài)學(xué)顯示方法的建立也為研究感覺(jué)刺激信息的傳導(dǎo)通路提供了一個(gè)快捷、敏感和方便的研究手段。雖然結(jié)果是通過(guò)形態(tài)學(xué)方法顯示，但在某種程度上反映了一定的功能意義，是一種形態(tài)學(xué)和功能學(xué)相結(jié)合的

8、指標(biāo)。作者發(fā)現(xiàn)，預(yù)先腹腔注射卵清蛋白根底致敏后再進(jìn)展食管酸灌注激活了一個(gè)復(fù)雜而廣泛的大腦網(wǎng)絡(luò)，NS內(nèi)從皮質(zhì)至延髓有廣泛的Fs蛋白表達(dá)，且在多個(gè)部位Fs陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比單純的食管酸灌注組或卵清蛋白致敏組明顯增多并集中分布，且所激活的腦區(qū)更多，多數(shù)為深染。這說(shuō)明卵清蛋白根底致敏對(duì)食管酸灌注誘發(fā)的NS內(nèi)Fs表達(dá)有活化作用，增加了多個(gè)腦區(qū)的FLI神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)和增強(qiáng)-fs基因表達(dá)的強(qiáng)度。此項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明慢性的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)可能易化了某種痛覺(jué)傳遞過(guò)程并促進(jìn)了食管內(nèi)臟的痛覺(jué)過(guò)敏形成，并由此導(dǎo)致NS疼痛“標(biāo)志物Fs蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，也提示采用腹腔注射雞卵清蛋白致敏結(jié)合食管酸灌注來(lái)制備內(nèi)臟高敏感性大鼠模型是可行和成功的

9、。【參考文獻(xiàn)】1HngSJ，KB，JungIS，etal.RelevanefineffetiveesphagealtilityandhyperativeaidsensitizatininpatientsithgastresphagealrefluxJ.JGastrenterlHepatl，2022,22(10):1662-1665.2RingelY.NediretinsinbrainiagingresearhinfuntinalgastrintestinaldisrdersJ.DigDis，2022,24(3-4):278-285.3SngGH,VenkatraanV,HKY,etal.rti

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