樺褐孔菌石油醚提取物的抗腫瘤作用研究

1、樺褐孔菌石油醚提取物的抗腫瘤作用研究【摘要】目的討論樺褐孔菌石油醚提取物InntusbliquusPetrleuetherExtrats,IPE抗腫瘤作用。方法體外實驗采用TT法測定了IPE對Hela腫瘤細(xì)胞的抑制率。體內(nèi)實驗，將接種S180腫瘤細(xì)胞后的小鼠隨機分為5組，每組10只，給予IPE10d，停藥后24h處死動物，稱體重，摘出腫瘤，測定腫瘤抑制率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、NK細(xì)胞活性。結(jié)果在體外，IPE對Hela腫瘤細(xì)胞具有毒性作用；體內(nèi)實驗說明中大劑量IPE對荷瘤小鼠腫瘤生長具有抑制作用，可增加脾指數(shù)及胸腺指數(shù)，對體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能和NK細(xì)胞活性亦有增強作用。結(jié)論樺褐孔菌

2、石油醚提取物具有明顯的抗腫瘤活性?！娟P(guān)鍵詞】樺褐孔菌石油醚提取物抗腫瘤TheExperientalStudynAntiturEffetfPetrleuEtherExtratsfInntusbliquusAbstrat：bjetiveTstudytheantitureffetfpetrleuetherextratsfInntusbliquus(IPE).ethdsInvitrtest,theturinhibitryeffetstHelaellserestudiedbyTTethd.Inviv,theieereinulatedithS180turellsanddividedint5grupsran

3、dly(n=10),hihereadinisteredIPE10dntinuusly.TheieerekilledandEighed24hafterthelastadinistratin,andtheinhibitinratiftheturEIghtinthespleenindex,thyusindex,transfratinfuntinflyphyteandNKellativitieserealulated.ResultsThevitrtestshedIPEhadsignifiantautetxiityttheHelaturells.TheIPEuldinreasethelevelsfinh

4、ibitinratiftureightandthespleenindexandthyusindexinieandinreasethetransfratinfuntinflyphyteandNKellativitiesinvitr.nlusinTheIPEhasbviusantitureffet.Keyrds：PetrleuetherExtratsfInntusbliquus(IPE)；Antitur樺褐孔菌Inntusbliquus是一種大型真菌，主要分布于北緯4550的地區(qū)，如俄羅斯西西伯利亞、遠(yuǎn)東地區(qū)、中國黑龍江、吉林省長白山地區(qū)等。作為一種民間草藥，樺褐孔菌在俄羅斯等國家已有很長的使用歷

5、史。近年的研究也說明，它在抗腫瘤、抗HIV、治療糖尿病等方面都具有一定的潛力15。成分研究說明，樺褐孔菌低極性提取物中含有大量的三萜類化合物，主要為羊毛甾醇、樺褐孔菌醇及其衍生物。本文通過體內(nèi)和體外實驗對樺褐孔菌中石油醚提取物抗腫瘤方面的作用及機理進(jìn)展了研究。1材料與方法1.1藥品的制備樺褐孔菌子實體購自大連王力靈芝行，由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室鄭維發(fā)教授鑒定，樣品保存于江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室。將樺褐孔菌子實體稱重、粉碎后用石油醚加熱萃取屢次，過濾。濾液經(jīng)濃縮枯燥后得到樺褐孔菌石油醚提取物，記為IPE。1.2動物與試劑1.2.1動物及瘤株昆明種IR小鼠，體重為202g，徐州醫(yī)

6、學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號：蘇動202202。自由攝食飲水，室溫252。S180肉瘤細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞、K293人胚腎細(xì)胞，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所提供。1.2.2試劑TT，美國Siga公司產(chǎn)品；DS，美國Siga公司產(chǎn)品；注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞藥業(yè)股份產(chǎn)品，消費批號040221；生理鹽水，徐州遠(yuǎn)恒藥業(yè)產(chǎn)品，消費批號04121311；RPI1640培養(yǎng)基、RPI1640完全培養(yǎng)基，美國GIB公司產(chǎn)品；PBS溶液實驗室自制。1.3方法1.3.1IPE對腫瘤細(xì)胞的抑制實驗6分別取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞及K293細(xì)胞1105/l接種于96孔培養(yǎng)板中，150l/孔，然后參加50l不

7、同濃度的IPE，總體積200l/孔，藥品的終濃度為0，50，100，200，300，500g/l，每組均設(shè)6個樣本孔。在37，5%2、飽濕條件下培養(yǎng)72h，以TT比色法測吸光度并計算藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率和對K293細(xì)胞的生長促進(jìn)率。1.3.2IPE對小鼠S180肉瘤的抑制作用實驗7取傳代后7d的S180肉瘤細(xì)胞懸液2106，每鼠右后腋窩皮下接種0.2l。次日隨機分組，每組10只，于接種后24h給藥。分別為IPE高劑量組(240g/kg)，中劑量組(120g/kg)，低劑量組(60g/kg)，環(huán)磷酰胺陽性對照組(20g/kg)，生理鹽水對照組以及正常對照組，均以0.2l/10g灌胃給藥，1次/

8、d，連續(xù)10d。末次給藥后24h，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，別離、摘取脾臟和胸腺，計算抑瘤率，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。1.3.3淋巴細(xì)胞增殖實驗8荷瘤小鼠按1.3.2條件給藥10d，于停藥24h后將小鼠放血致死，取脾，按文獻(xiàn)制備脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞濃度調(diào)整為4106/l，向96孔板參加脾細(xì)胞懸液100l/孔，然后參加1g/l的nA100l/孔，對照孔加RPI1640液，設(shè)5個復(fù)孔，置37，飽和濕度、5%2孵箱中培養(yǎng)72h，以TT法測D值，以D值大小反映淋巴細(xì)胞增殖反響。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.3.4IPE促進(jìn)NK細(xì)胞活性實驗9同1.3.3處理動物和制備脾細(xì)胞，取不同藥物濃度處理的脾細(xì)胞作效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞

9、濃度至1106/l，參加96孔培養(yǎng)板中，另取Hela細(xì)胞作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞=50:1，每份標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)靶細(xì)胞對照組和效應(yīng)細(xì)胞對照組，置37，5%2孵箱中培養(yǎng)4h，并以TT法于酶標(biāo)儀570n波長處測光密度D值，并計算NK細(xì)胞活性。1.4數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.5軟件進(jìn)展處理，以t-檢驗計算組間的差異。2結(jié)果2.1IPE對腫瘤細(xì)胞的抑制實驗結(jié)果見表1。表1樺褐孔菌石油醚提取物對Hela細(xì)胞和K293細(xì)胞的增殖抑制略從實驗結(jié)果可知，IPE各劑量組對腫瘤的抑制率均大，且根本呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，細(xì)胞毒作用明顯。同時多個劑量組IPE對K293的生長都呈現(xiàn)較高的生長促進(jìn)率，說明

10、了IPE對正常細(xì)胞的增殖無抑制作用。2.2IPE對小鼠S180肉瘤抑制率的影響結(jié)果見表2。表2樺褐孔菌石油醚提取物對小鼠S180肉瘤的腫瘤抑制率的影響略結(jié)果說明，與空白對照組相比擬，IPE的中大劑量組對荷瘤小鼠的腫瘤均具一定程度的抑制作用。結(jié)果還說明，IPE具有明顯增加荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用，呈劑量依賴關(guān)系，且與陽性對照組間存在顯著性差異。2.3淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果見表3。表3樺褐孔菌石油醚提取物對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用略結(jié)果說明在nA的誘導(dǎo)下荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖普遍低于正常小鼠，而中大劑量IPE能有效進(jìn)步實驗D值，且與陽性對照組存在顯著性差異P0.01，這說明IPE能有效地促進(jìn)

11、淋巴細(xì)胞的增殖，可以進(jìn)步荷瘤小鼠的免疫程度。2.4IPE促進(jìn)NK細(xì)胞活性實驗結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示IPE能有效促進(jìn)NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，而且中大劑量組明顯高于環(huán)磷酰胺陽性對照組和正常對照組的NK細(xì)胞活性。3討論從天然產(chǎn)物特別是大型真菌中挑選抗腫瘤活性物質(zhì)是抗腫瘤新藥物研發(fā)的一個重要方向。一般認(rèn)為大型真菌是通過調(diào)節(jié)機體的免疫力，從而起到抗腫瘤的療效的，但研究的重點多集中在真菌的水提物組分上。本研究通過體內(nèi)外抗腫瘤實驗和免疫藥理學(xué)實驗對樺褐孔菌多糖的抗腫瘤作用及機制進(jìn)展了研究。體外對Hela腫瘤細(xì)胞的增殖實驗說明當(dāng)給藥濃度為50g/l時，IPE就具有直接殺死腫瘤細(xì)胞的

12、細(xì)胞毒作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；同時實驗還說明，IPE對正常細(xì)胞的增殖無抑制作用，大濃度時甚至能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長。體內(nèi)抗腫瘤實驗的結(jié)果說明，120g/kg以上劑量的IPE灌胃給藥時，對小鼠S180肉瘤均有一定的抑制作用。腫瘤的發(fā)生開展與機體的免疫調(diào)節(jié)功能親密相關(guān)，其中由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫起著更重要的作用，T細(xì)胞的激活是發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)的重要條件。NK細(xì)胞缺乏免疫記憶和H約束性，能溶解廣譜的腫瘤細(xì)胞、包括同基因的、同種異基因的，以及異種的靶細(xì)胞，是一類在早期腫瘤免疫機制中起重要作用的效應(yīng)細(xì)胞，對機體抗腫瘤起著重要作用。本研究在證實IPE具有良好抗腫瘤效果的根底上，討論了IPE對小鼠S180肉

13、瘤的免疫調(diào)節(jié)作用及可能機理。實驗說明IPE對兩個主要免疫學(xué)器官脾臟和胸腺均有增重作用，并呈劑量依賴性。與陽性對照組相比，中大劑量組IPE可促進(jìn)nA誘導(dǎo)的體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時，各劑量組IPE對荷瘤小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性均有明顯促進(jìn)作用。以上結(jié)果顯示，IPE的抗腫瘤作用可能是通過其細(xì)胞毒作用及調(diào)節(jié)機體的免疫力，刺激T細(xì)胞、NK細(xì)胞等功能來實現(xiàn)的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌樺褐孔菌J.中國食用菌,2001,21(4):7.2NazareizT,LedhshiZ,KnpaJ,etal.Studiesnantineplastiprpertiesfpriablique.II.stu

14、diesntheeffetfpriabliquanthegrthftransplantertursinanialsJ.Ntry,1961,11:401.3T.izun,.Zhuang,K.Abe,H.kat,T.Kih,S.Uai,S.LelerandL.Eijer,AntiturandhypglyeiativitiesfplysaharidesfrtheslertiaandyeliafInntusbliquus(Per.:Fr.)Pil,(Aphyllphryetideae)J.InternatinalJurnalfediinalushrs,1999,1:301.4ValentinaG.Babitskaya,NinaA.Bisk,NadezdaYu.itrplskaya,etal.elaninplexfrediinalushrInntusbliquus(Pers.:Fr.)Pilat(haga)(Aphyllphryetideae)J.InternatinalJurnalfediinalushrs,2002,4.139.5Yngui,Dng-SekKi,Kyung-hanPark.AntixidanteffetfInntusbliqu