葉綠體的分離與熒光觀察

1、本文格式為Word版，下載可任意編輯 葉綠體的分離與熒光觀察 . . . . 葉綠體的分開及熒光觀測 【試驗?zāi)康摹?1.學(xué)習(xí)使用差速離心法獲取葉綠體 2.通過植物細胞葉綠體的分開，了解細胞器分開的一般原理和方法。 3.觀測葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。 【試驗原理】 1.高等植物中葉綠體象雙凸或平凸透鏡，長徑510um，短徑2-4um，厚2-3um。 高等植物的葉肉細胞一般含50-200個葉綠體，可占細胞質(zhì)的40%。、 葉綠體的數(shù)目因物種細胞類型，生態(tài)壞境，生理狀態(tài)而有所不同。在藻類中葉綠體外形多樣，有網(wǎng)狀，帶狀，裂片狀和星形等等，而且體積巨大，可達100um. 葉綠

2、體由葉綠體外被，類囊體和基質(zhì)3部分組成。 葉綠體含有3種不同的膜：外膜，膜，類囊體膜和三種彼此分開的腔：膜間隙，基質(zhì)和類囊體腔。 2.勻漿破碎細胞，利用差速離心方法分開等滲介質(zhì)中的懸浮顆粒。收集類葉綠體大小的顆 粒，得到葉綠體。 差速離心法：顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、外形和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間，密度和大小不同的顆粒其沉降速度不同。 依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部分批收集即可獲得各種亞細胞組分。 葉綠體的分開應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)

3、中進行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。 分開過程最好在05的條件下進行：假如在室溫下，要迅速分開和觀測。 3.差速離心法 特點：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心 用途：分開大小相差懸殊的細胞核細胞器 沉降順序：核葉綠體，線粒體溶酶體與過氧化物體質(zhì)網(wǎng)與高爾基體核蛋白體 可將細胞器初步分開，常需進一步通過密度梯度離心再行分開純化。 【試驗材料】 1. 試劑：0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01吖啶橙。 2. 器具：粗天平、組織搗碎機、普通離心機、普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、500ml 燒 杯、量筒、滴管、10ml刻度離心管、紗布若干，試管架、無熒光載玻片和蓋玻片。 3. 材料：新鮮菠菜。

4、 【試驗步驟】 1.選取新鮮嫩濾菠菜葉，去除葉梗及粗脈，洗凈擦干，稱30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中； 2.將葉和液同裝入組織搗碎機中，勻漿3-5min，轉(zhuǎn)速5000r/min； 3.將勻漿液用6層紗布過濾到500ml燒杯中； . 學(xué)習(xí).資料. . . . . 4.取濾液4ml在1000r /min下離心2min； 5.取上層清液在3000r/min下離心5min（沉淀為葉綠體和細胞核混合物）； 6.將沉淀用2-3ml 0.35mol/L氯化鈉液懸?。?7.取一滴懸液滴片，加蓋片后顯微鏡下觀測。 8.另取一滴懸液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，混勻，蓋上蓋片后，在

5、熒光顯微鏡下觀測。 【試驗結(jié)果】 普通光學(xué)顯微鏡下對葉綠體的觀測 圖表1普通光學(xué)顯微鏡下菠菜葉的葉綠體（10*40） 普通光學(xué)顯微鏡下可看到：菠菜葉綠體呈綠色的橄欖形 由于離心不當，帶有一定量的雜質(zhì) . 學(xué)習(xí).資料. . . . . . 學(xué)習(xí).資料. 圖表 2普通光學(xué)顯微鏡下葉綠體局部放大圖（10*40） 細心觀測可看到基粒深綠色的小顆粒 熒光顯微鏡下的葉綠體 圖表 3熒光顯微鏡下未被染色的葉綠體（10*40） . . . . 熒光顯微鏡下可觀測到：未被染色的葉綠體自發(fā)熒光為火紅色，呈點狀分布，其他部分為黑色。 圖表4熒光顯微鏡下已被染色的葉綠體（10*40） 吖啶橙染色后熒光顯微鏡下，對葉綠

6、體的觀測：葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光。 其他大部分，背景為綠色。 【試驗結(jié)果分析】 1.普通光學(xué)顯微鏡下觀測到的葉綠體呈綠色橄欖形，高倍鏡下細心觀測可看到葉綠體部含 有深綠色的小顆?；?。另外還可以觀測到外形較小且不規(guī)矩的組織碎片，這是由于在離心過程中，由于離心不完全造成葉綠體沉降物中含有其他組織碎片。 2.熒光顯微鏡下，葉綠體自發(fā)熒光為“火紅色，次生熒光為“桔紅色。 3.未染色的玻片在熒光顯微鏡下觀測，葉綠體為“火紅色，呈點狀分布，且背景為黑色。 這是由于葉綠體自身在懸液中呈點狀分布，并且其中的葉綠素在經(jīng)過激發(fā)光波照射后，可放出火紅色的自發(fā)熒光，并且懸液中的其他成份不發(fā)生熒光反應(yīng) 4.染色后的玻

7、片在熒光顯微鏡下觀測，葉綠體為“桔紅色，其中混有的細胞核碎片中含 有的核酸在吖啶橙的作用下呈綠色。背景空白處為綠色，這是由于載玻片有雜質(zhì)?！驹囼灴记绊氈?1.熒光顯微鏡有兩套光源系統(tǒng)，先在自然光源下調(diào)整好觀測視野，再切換到熒光光源觀測。 . 學(xué)習(xí).資料. . . . . 2.要注意正確的使用熒光顯微鏡： （1）不要直接觀測激發(fā)光源，保護眼睛 （2）熒光染料有一定毒性，要做好防護 （3）觀測熒光受多種因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等 （4）在熒光觀測時應(yīng)抓緊時間，立刻拍照，防止熒光會發(fā)生淬滅，造成整體發(fā)紅。 （5）熒光顯微鏡不能隨便開關(guān)，汞燈開啟15分鐘之不能關(guān)閉。 3.葉綠體的分開應(yīng)在等滲溶

8、液（0.35mol/L NaCl）中進行，以免滲透壓的改變使葉綠體受 損傷； 4.制作裝片，滴加懸液時，先用吸管吹勻懸液，滴加時，不能滴加太多，若滴加過多的話， 則用濾紙片吸取多余液體，否則，觀測目標在鏡頭下漂流，不便利觀測。 5.吖啶橙可染細胞核，對人體危害對比大，不能用手直接接觸。 6.離心管務(wù)必等量，對稱地放入離心機中； 7.分開終止后，先關(guān)閉離心機，在離心機完全中止轉(zhuǎn)動后，才可開啟離心機，取出試樣。 8.差速離心法不能得到完全純潔的葉綠體，要想獲得更純的葉綠體，可以用密度梯度離心 法。 9.制片時注意所取的懸液盡量適量，保證視野中的葉綠體的數(shù)量。 【試驗反思】 1.葉綠體的稀釋倍數(shù)要恰當，數(shù)量太少在熒光顯微鏡下難以觀測到。我們組一開始制作的 玻