拉米夫定或替比夫定耐藥患者PBMCs內(nèi)HBVDNA水平和HBVDNA聚合酶區(qū)耐藥突變模式

1、拉米夫定或替比夫定耐藥患者PBMCs內(nèi) HBVDNA水平和 HBVDNA聚合酶區(qū)耐藥突變模式研究背景及目的乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球面臨的重要公共衛(wèi)生問題。HBV 慢性感染的病人肝臟損害會持續(xù)進展, 最終會導(dǎo)致肝硬化或肝細胞癌的發(fā)生。HBV感染增加了肝臟并發(fā)癥和死亡率的風(fēng)險, 給人民群眾生活帶來嚴重的經(jīng)濟負擔。為了降低HBV感染病人的并發(fā)癥和死亡率, 抗病毒治療是唯一有效的治療手段。目前治療 HBV慢性感染的抗病毒藥物包括兩大類： 干擾素和核苷 ( 酸) 類藥物。盡管應(yīng)用干擾素可能會導(dǎo)致持久的病毒學(xué)應(yīng)答, 但干擾素的不良反應(yīng)及高昂的治療花費限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。因此 , 核苷 ( 酸

2、) 類藥物成為抗 HBV病毒最常用的藥物。核苷( 酸) 類藥物作用于 HBV DNA聚合酶基因的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū) , 抑制病毒復(fù)制。盡管多種抗病毒藥物已應(yīng)用于臨床 , 但還沒有一種藥物能夠徹底清除 HBV感染 , 這決定了抗病毒治療的長期性。核苷 ( 酸) 類似物長期抗病毒治療的不良后果就是出現(xiàn)耐藥病毒株。拉米夫定和替比夫定均屬于左旋核苷酸。 與左旋核苷酸相關(guān)的耐藥位點是發(fā)生在聚合酶基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū) YMDD模序內(nèi)的突變 , 即 rtM204I/V 。研究表明外周血單核細胞 (PBMCs)中存在 HBV感染 , 且其病毒載量與血清當中 HBVDNA水平相關(guān)。而對于經(jīng)核苷 ( 酸 ) 類似物治療并產(chǎn)生耐

3、藥突變的慢性乙型肝炎患者 PBMCs中 HBV DNA水平與血清當中 HBV DNA載量的關(guān)系未見報道。盡管很多研究已經(jīng)報道了血清當中 HBVDNA聚合酶基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變的特點 , 而對于 PBMCs中是否同樣存在類似的耐藥相關(guān)突變,PBMCs及血清中 HBV耐藥模式是否相同未見報道。 核苷 ( 酸) 類似物治療產(chǎn)生耐藥突變的慢性乙型肝炎患者經(jīng)優(yōu)化抗病毒治療方案后, 其抗病毒治療對 PBMCs中 HBV轉(zhuǎn)陰的作用如何 ,我們尚不清楚。本研究的目的是檢測拉米夫定和替比夫定耐藥患者血清和PBMCs中 HBVDNA水平 , 探討其相關(guān)性；檢測這些耐藥病人PBMCs內(nèi) HBV DNA聚合酶基因逆

4、轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變模式；探討經(jīng)優(yōu)化的抗病毒治療對這些耐藥病人PBMCs中 HBV DNA的治療效果。材料和方法51 例病人均為 2012 年 1 月 2013 年 1 月來山東大學(xué)附屬濟南市傳染病醫(yī)院門診就診或住院的慢性乙型肝炎患者。所有病人正在接受抗病毒治療至少半年, 且在服藥期間出現(xiàn)病毒學(xué)突破(HBVDNA水平比治療中的最低點上升至少1 個 log10copies/ml)。將病人分為拉米夫定組 (LAM組： 32 例) 和替比夫定組 (LdT 組,19 例) 。對于血清中檢測到LAM或 LdT 耐藥的病人 , 加用阿德福韋酯 (ADV,l0mg/ 天)治療 , 收集基線、 24 周和 48

5、周血清及相應(yīng) PBMCs。應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測血清及相應(yīng) PBMCs中 HBV DNA,應(yīng)用直接測序的方法檢測HBV DNA聚合酶基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變情況。應(yīng)用 SPSS13.0對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。 研究結(jié)果 1 患者基線特征 51 例入組病人均為中國漢族人口 ,HBV基因分型顯示均為C型。20 例病人 (39.22%；LAM組： 11 例,LdT 組： 9 例) 血清及 PBMCs中均未檢測到耐藥突變。 31 例檢測到突變病人全部為HBsAg陽性 , 大部分病人是男性 ,HBeAg陽性。兩組病人基線特征比較無差別。2 血清和 PBMCs HBVDNA水平比較 LAM組和LdT 組病人

6、血清和 PBMCs中均檢測到 HBV DNA。LAM組 21 例病人血清 HBV DNA水平為 5.87 1.041og10copies/ml, PBMCs中 HBV DNA水平為 4.63 1.14 log10copies/ml; LdT組 10 例病人血清 HBV DNA水平為 5.82 0.82log10copies/ml, PBMCs中 HBV DNA水平為 4.23 0.901og10copies/ml 。無論是 LAM組還是 LdT 組 , 血清中 HBV DNA水平明顯高于PBMCs(LAM組： t=5.69,P0.05：LdT 組： t=9.87,P0.05)。3 血清和 PM

7、BCs中 HBVDNA水平相關(guān)性分析不論是LAM組還是 LdT 組 ,PBMCs中 HBV DNA水平與血清中 HBV DNA水平呈明顯正相關(guān) (LAM 組:r=0.584,p0.01;LdT 組： r=0.829,p0.01)。4 血清和 PMBCsHBVDNA耐藥突變模式血清和 PBMCs中 HBV DNA聚合酶區(qū)耐藥突變不完全相同。在 LAM組耐藥的病人 , 血清中檢測到三種耐藥突變模式：單位點突變(rtM204I,3/21,14.29%)、雙位點突變 (rtL180M+rtM204I或者 rtL180M+rtM204V或者 rtL180M+rtM204I/V,11/21,52.38%)

8、 及三個位點突變 (rtL180M+rtM204I+ 其它或者 rtL180M+rtM204V+其它或者 rtL180M+rtM204I/V+ 其它 ,7/21,33.33%)。在本組病人的 PBMCs中, 也檢測到了三種突變模式。進一步分析發(fā)現(xiàn) ,85.71%(18/21) 的病人 , 其 PBMCs中 HBV耐藥突變模式與血清中 HBV突變模式相同。在 LdT 組病人血清中檢測到了兩種耐藥突變模式：單位點突變 (rtM204I,8/10,80.00%)和雙位點突變 (rtL180M+rtM204I,2/10,20.00%)。在 LdT 組病人 ,75%(6/8) 病人血清和 PBMCs中

9、HBV耐藥模式相同。 5 抗病毒治療對 PBMCs中 HBV的影響 31 例產(chǎn)生耐藥病人加用阿德福韋酯(10mg/d) 治療 ,24周時有 1 例病人失訪 ( 此病人為 LdT 耐藥患者 ) 。21 例 LAM耐藥病人 , 有 10 例病人血清和 PBMCs中仍能檢測到HBVDNA(血清：4.261. Ollog.ocopies/ml, PBMCs:4.060.981og10copies/ml)。經(jīng) 24 周抗病毒治療 , 這 10 例病人血清中 HBV DNA下降幅度高于 PBMCs中 HBVDNA下降幅度 (t=5.62,p0.05)； 9 例 LdT 耐藥病人在加用阿德福韋酯治療24 周時 ,3 例病人血清及 PBMCs中檢測到了病毒 , 其余 6 例血清及 PBMCs中均未檢測到病毒。至隨訪 48 周時 ,LAM耐藥病人有 1 例失去聯(lián)系。 20 例病人中有 19(95%)例血清及 PBMCs中均未檢測到病毒。9 例 LdT 耐藥病人在 48 時血清及 PBMCs中均未檢測到病毒。結(jié)論 LAM或 LdT耐藥病人 PBMCs中 HB