(完整版)m6A甲基化研究方法

1、( 完整版)m6A甲基化研究方法RNA 甲基化修飾(m6A ）研究思路及方案設(shè)計甲基化修飾約占所有修飾的以上，而甲基腺嘌呤是高等生物和lcs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)icrocirc, rtA 和so上都有發(fā)生6A修飾.6A 修飾主要發(fā)生在序列中的腺嘌呤上，其功能由編碼器 (riter ”消碼器 (rser)和讀碼器(eer決定1編碼器(riter)即甲基轉(zhuǎn)移酶, 目前已知這個復(fù)合物的成分有 ， 14和1429而和作為去甲基酶（消碼器)可逆轉(zhuǎn)甲基化；6由6結(jié)合蛋白識6（讀碼器有（包括123和2和核不均一蛋白家族（P21P。m6A酶系統(tǒng)METTL3是早先被鑒定為結(jié)合 SAM的組件，其缺失引起小鼠

2、胚胎干細胞、Hela 細胞和 HepG2 細胞中 m6Apeaks的減少及其同源蛋白1（cler secle)上，顯示修飾可能和的剪切加工相關(guān)與31二聚體相互作用，并共定位于目前已發(fā)現(xiàn) FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長遲緩相核小斑，影響甲基化效率，參與 剪。而 142作為候選的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的新亞基，是整體甲基化進程所必須的家族的成員，作為第一個被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶結(jié)合能力目前已發(fā)現(xiàn) FTO調(diào)節(jié)異常與肥胖、大腦畸形和生長遲緩相關(guān)，揭示6可能對這些疾病具有重要的調(diào)節(jié)功能4-6是家族中被發(fā)現(xiàn)具有去甲基作用的另一個成員, 以seA敏感的方式與核小斑共定位，它可直接催化 6甲基化腺苷去除甲基而不同于

3、O的氧化去甲基7.此外和它的去甲基化活性影響新生合的成和剪切效7，且敲除雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常，這可能是精子發(fā)生相關(guān)基因表達改變的結(jié)果76A修飾執(zhí)行其功能主要通過兩個途徑： 精細調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu),以阻止或誘使蛋白相互作用;或被直接由m6A 結(jié)合蛋白識別，誘發(fā)后續(xù)反應(yīng)。目前一類含有 功能結(jié)構(gòu)域的蛋白被鑒定為 m6A修飾的結(jié)合蛋白. 其中1,2 3,1和己被證實是的結(jié)合蛋白.1 主要影響修飾基因的翻譯主要影響修飾基因的降解，而 結(jié)合修飾的基因后影響其剪接。C一種豐富的核結(jié)合蛋白,參與re的加工8且研究表明P通過6與A結(jié)合調(diào)控目標轉(zhuǎn)錄本的豐度和選擇性剪切( 完整版)m6A甲基化研究方法圖1

4、 m6A 修飾的酶系統(tǒng)10 m6A生物學功能越來越多的證據(jù)表明 m6A修飾在哺乳動物中發(fā)揮重要的生物功能。例如，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控 RNA的穩(wěn)定性11、定位12、運輸、剪切13和翻譯14。. pri-miRNA甲基化，會的成熟15 識別蛋白促進pri-miRNA 加工成pre-miRNA 16的翻譯17。修飾在基因表達調(diào)控中起著重要的作用 , 其調(diào)控機制的異?？赡芘c人類疾病或癌癥相關(guān) . 目前發(fā)現(xiàn) m6A可能會影響精子發(fā)育（53tc（3（誘導的損傷反應(yīng)(，、腫瘤生成（2 或轉(zhuǎn)移（1干細胞更新（ 脂肪分化(FTO)、生物節(jié)律、細胞發(fā)育分化、細胞分裂及其它的一些生命過程。例如敲除的雄性小鼠增加了中

5、的(）A修飾，其特點是凋亡影響減數(shù)分裂中期的精子細胞,引起生育能力受損。和1增加弱精癥精子的 水平18 ，在生殖細胞中的敲除嚴重抑制精子分化和減數(shù)分裂的發(fā)生，轉(zhuǎn)錄組和 分析顯示精子發(fā)生相關(guān)基因的表達和選擇性剪接發(fā)生了改變1?？纱龠M靶基因的翻譯效率,并降低其的豐度, 在精子發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。當減數(shù)分裂開始時表達上調(diào)敲除小鼠的生殖細胞沒有經(jīng)過偶線期的發(fā)育導致小鼠不育20在損傷反應(yīng)中可促進聚合酶（Pol ）與核酸 剪切修復(fù)途徑快速定位到引起的損傷位點，當缺失時，細胞無法迅速修復(fù)照射引起的突變, 并且對照射更加敏感25在淋巴細胞性小鼠過繼轉(zhuǎn)移模型中ettl3缺陷通過影響6修飾,( 甲基化研究方法降

6、低家族衰減,增加L7介導的5 活性和T細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)增殖和分化，進而抑制腸炎的發(fā)生2。在肝癌中，1通過調(diào)控ri-iA的6修飾,影響i-126的生成加工，從而抑制肝癌的轉(zhuǎn)移22 的表達, 而過表達降低了的6修飾，從而穩(wěn)定提高的表達水平，最終增加乳腺癌干細胞所占的比例23。 此外， 低氧誘導乳腺癌細胞中依賴21的和4 的6A甲基化抑制5 除顯著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移24能夠促進肺腺癌細胞的生長、生存和侵襲，但還不清楚它是否作為 m6A 調(diào)節(jié)器或效應(yīng)器發(fā)揮作用25 。在急性髓細胞白血病) 者中，m（6A 調(diào)控基因的突變或拷貝數(shù)變化與 突變存在密切聯(lián)系，且 m（6）A 調(diào)控基因的改變與不良預(yù)后相關(guān)

7、26 。此外，在中高表達，它通過降低轉(zhuǎn)錄本中的（）水等靶點的表達，增強了白血病癌基因介導的細胞轉(zhuǎn)化和白血病形成，并抑制全反式維甲酸(誘導的細胞分化27. 表達與635通過lcA介導基因re上的6修飾維持膠質(zhì)瘤細胞的成瘤性2。此外, 甲基轉(zhuǎn)移酶或1的敲除, 能夠改變6的富集和9大地促進了膠質(zhì)瘤細胞的生長、自我更新和腫瘤形成 29.表達，極圖 2 m6A RNA修飾和介導的功能30m6A的研究方向主要是通過研究m6A 修飾相關(guān)的甲基化、去甲基化酶和識別蛋白的功能，進而研究 修飾的生物學功能和作用機制: 酶分子, 研究下游功能基因分子的表達和 介導相關(guān)基因異常（調(diào)控影響細胞表型和功能特征。( 完整版

8、)m6A甲基化研究方法修飾圖譜構(gòu)建及作用機制：通過甲基化測序 ）構(gòu)建疾病細胞模型或者發(fā)病組織的m6A 修飾譜分析的motif, 數(shù)量及分布,Peak關(guān)聯(lián)基因的特征,聯(lián)合研究 m6A甲基化與表達的關(guān)系。研究思路研究方案( 完整版)m6A甲基化研究方法疾病樣本 VS 正常樣本m6A修飾圖譜分析m6A修飾差異基因分析差異表達基因m6A 修飾特征分析差異表達基因關(guān)聯(lián)分析方案一驗證( 甲基化研究方法 等 數(shù)據(jù)庫 篩選異常 表達 的m6A 相關(guān)基因（ 疾病vs 正常）臨床樣本qPCR驗證目標基因腫瘤細胞中干擾目標基因MeRIP-Seq等檢測細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移篩選下游基因方案二驗證目標基因通調(diào)控下游

9、基因研究案例研究案例一 （ m6A修飾圖譜分析）( 完整版)m6A甲基化研究方法SKlein-HitpassHorsthemkeN6-adenosine methylation in is PoSe2015 ，10(2 ：e011843。在許多不同種類的 中，都已觀察到 6 - 腺苷（6）的甲基化，但其在 icros中還沒有被研究。研究者在 1，24 和33 細胞系中，通過敲除 6甲基轉(zhuǎn)移酶 篩選到表達差異的 icro,microRNA敲除對甲基化的的穩(wěn)定狀態(tài)的影響。研究案例二（機制研究J，g ou , iu ，n Jg , ，u ,oun : resses the metastatic po

10、tential ofhepatocellular carcinoma modulating -methyladenosine-dependentprimary MicroRNA processing。 Hepatology 2017， 65（2) ：529-543。, 修飾是否參平在肝癌中下調(diào)。為研究哪些因子導致 在肝癌的下調(diào)，作者在 20 例肝癌及癌旁中檢測 甲基化酶和去甲基酶的表達， 130作為肝癌預(yù)后因子，細胞實驗發(fā)現(xiàn)其敲除可增強肝癌轉(zhuǎn)移。接下來作者研究 抑制肝癌轉(zhuǎn)移的機制，由于已有研究顯示 m6A修飾能夠增強 蛋白識別，促進pri的表達發(fā)現(xiàn)m6A相互作用且敲除11通過6修飾促進識別ri

11、 i12。( 完整版)m6A甲基化研究方法修飾促加工，從而抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移。圖 11在肝癌中下調(diào)圖 21依賴的6通過 G8126 加工研究案例三( 機制研究）IF=27。4控 iSLinSZ YEP,XieKO etal: Demethylase Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells Sustaining FOXM1 ExpressionCellProliferationProgram。CancerCell2017, 31(4) e596 。甲基化異常是膠質(zhì)瘤的表觀遺傳調(diào)控因子，但甲基化在腫瘤包括惡性膠質(zhì)瘤（中的調(diào)控還

12、尚未清楚。為研究6調(diào)節(jié)可能導致患者臨床療效不佳，作者通過數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤樣干細胞制 s增殖，進一步體內(nèi)驗證敲除 可抑制腫瘤生長。為研究的66seq 篩選到膠質(zhì)瘤增殖相關(guān)的最后通過P、 、免疫熒光、核質(zhì)分離/PP和e等實驗證明通過去甲基化初期轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)在 中的表達。1 作用是否受其他因子的調(diào)節(jié)鄰近基因，發(fā)現(xiàn) lncRNAFOXM1-AS與序列互補，且共表達、共定位, 進一步通過P，Allon等實驗證明lcA1-進和初級轉(zhuǎn)錄本的相互作用。最后通過細胞實驗進一步驗證 在lcA1 S的1 的干性。( 完整版)m6A甲基化研究方法圖1 ALKBH5敲除細胞中m6A修飾的特征和基因表達的變化。Gen

13、eexpressionregulationmediatedthroughreversible m(6)A NatRevGenet15(5)：293-306。crtz chJooic ,，cig , sin ertis，er esn N，CacchiarelliDetal: Perturbationofm6Awritersrevealstwodistinctclassesofmethylationinternal5sites. CellRep2014, 8(1）:284。3.YXW, WJetalFTO-dependentdemethylation of N6-methyladenosine r

14、egulates splicingisrequiredfor iogeesis 。elles2014, 2（1：1403-1419.。JiaX，Li Q，BaileyNobregaMA etal:F-eiteortion of 6-roetleosiedorleosie in li.Nat。CommunC，MeyreDKornerA，JacobsonP,CarlssonKiessWV ，LecoeurCetalVariationincontributestochildhoodobesitysevereadultobesity。NatGenet39(6)：724726.BoisselS，Reis

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