自閉癥兒童大腦新皮質(zhì)裂解斑塊

1、干刊名： The New England journal of medicine影響因子：54.42出版年：2014題目： Patches of Disorganization in the Neocortex of Children with Autism自閉癥兒童的新皮質(zhì)上的裂解斑塊摘要背景：自閉癥包括大腦早期的過(guò)度發(fā)育和功能障礙，尤其在額葉前部的皮質(zhì)表達(dá)更明顯。一個(gè) 病理學(xué)分析估計(jì)，自閉癥兒童額葉前部皮質(zhì)的過(guò)量神經(jīng)元發(fā)射信號(hào)干擾出生前的發(fā)育，并且 伴發(fā)異常的細(xì)胞型和板狀發(fā)育。方法：為了在自閉癥發(fā)作后的早些年系統(tǒng)的檢查大腦的新皮層的結(jié)構(gòu)，我們應(yīng)用特異細(xì)胞型分 子作為標(biāo)記物的RNA原位雜交技

2、術(shù)來(lái)顯示皮質(zhì)的微細(xì)結(jié)構(gòu)。我們分析神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的 標(biāo)記物，還有那些被自閉癥牽涉的，額葉前部的、顳部的基因，還有枕部的大腦的新皮層的 組織。這些樣本來(lái)自患有自閉癥的和未患有自閉癥的2到15歲的兒童死后。結(jié)果：我們?cè)陬~葉前部和顳部皮質(zhì)組織觀察到異常的板狀的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的局部斑塊和神經(jīng)皮質(zhì) 的裂解，但不是神經(jīng)膠質(zhì)，這出現(xiàn)在10/11的自閉癥兒童和1/11的非自閉癥兒童中。在考慮 到斑塊是最不正常的細(xì)胞型，和板層很可能受病理特征影響時(shí)，我們觀察到了他們之間的特 異性。從第4、5層的異常表達(dá)的清晰的標(biāo)記可以看出，沒(méi)有皮質(zhì)層多余。皮層標(biāo)記物的三 維重建證實(shí)了板塊的局部位置和大小。結(jié)論：在這個(gè)小的探索性的研究

3、中，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)年輕的自閉癥兒童有板狀皮質(zhì)結(jié)構(gòu)的局部 斷裂。我們的數(shù)據(jù)支持，可能是在出生前的發(fā)育階段的層狀結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)異常和特異層狀神經(jīng)元 變異。在一定程度上，自閉癥是可遺傳的發(fā)育紊亂，大多數(shù)病人包括肉眼可見(jiàn)的早期大腦過(guò)度 發(fā)育和功能紊亂，影響皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域的自我調(diào)節(jié)中心，包括額葉前部和顳部的皮質(zhì)。潛 在的皮質(zhì)缺陷的仍然不能確定。不管早期可診斷的發(fā)作，有超過(guò)40個(gè)研究表明，尸檢分析 自閉癥患者的平均年齡是22歲。先前的三個(gè)研究評(píng)估4到60歲自閉癥患者的大腦尼斯?fàn)柸旧衅?，描述個(gè)體異位圖例， 輕微的局部板層狀裂解，室管膜下的發(fā)育不良，但是沒(méi)有報(bào)道共同的神經(jīng)病理學(xué)缺陷。然而， 觀察年輕的成年人，自

4、閉癥人的大腦不在擴(kuò)大，取而代之的是皮質(zhì)的變薄和神經(jīng)元的丟失， 這表明包含成人的自閉癥的研究可能不會(huì)揭示出神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形，而這在自閉癥兒童的大 腦中存在。自閉癥兒童大腦的分子、細(xì)胞還有組織的異常還有很多沒(méi)有被研究，早期的大腦 的增大和功能障礙的基礎(chǔ)仍然是推理的。最近，我們發(fā)現(xiàn)年輕的自閉癥兒童的基因和基因路徑的異常表達(dá)受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA 的完整性、細(xì)胞的分化、額葉前部的皮質(zhì)的發(fā)育來(lái)控制。我們同樣發(fā)現(xiàn)，和未患自閉癥的兒 童比，在2到16歲的自閉癥兒童之間，他們有異常重的大腦，并且額葉前部皮質(zhì)的神經(jīng)元 數(shù)量增加了 67%。盡管皮質(zhì)神經(jīng)的暫時(shí)性增加期望在懷孕的第3到6個(gè)月，但是這種增加 通常在出生

5、后或出生后的幾個(gè)內(nèi)消失，在這期間皮質(zhì)的板層狀發(fā)展和皮質(zhì)-皮質(zhì)下電通路會(huì) 發(fā)育成熟。盡管引起自閉癥患者神經(jīng)元數(shù)量增多的原因仍然不明確，但是這種異常出現(xiàn)在出 生前，而且期望能在早期皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程阻斷它，就像阻斷其他的已經(jīng)確定的紊亂一樣，例如 無(wú)腦回，多小腦回，腦裂還有皮質(zhì)異位這些由細(xì)胞周期進(jìn)程、神經(jīng)元異位、消減和凋亡缺陷 引起的紊亂。正如前人的研究的報(bào)告那樣，應(yīng)用MRI，功能MRI，基因表達(dá)，和神經(jīng)元計(jì) 數(shù)，我們猜測(cè)自閉癥兒童的新皮質(zhì)存在干擾，并且在額葉前部和顳部的皮質(zhì)可以探測(cè)到。 為了驗(yàn)證這個(gè)假說(shuō)，我們應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)比色RNA原位雜交技術(shù)系統(tǒng)的檢查一大組高度選擇性的 分子標(biāo)記物的表達(dá)，尸檢標(biāo)本來(lái)自患自閉

6、癥的兒童和非患自閉癥的兒童。這些標(biāo)記物包括刺 激劑亞型、抑制神經(jīng)元、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星型神經(jīng)膠質(zhì)和一組自閉癥候選者基因。方法標(biāo)記物選擇應(yīng)用原位雜交技術(shù)，我們分析了 63號(hào)基因的表達(dá)模式，包括背外側(cè)額葉前部皮質(zhì)的皮 質(zhì)特殊層狀標(biāo)記物，自閉癥涉及的基因，假定的細(xì)胞類型標(biāo)記物。這些樣本來(lái)自2名未感染 自閉癥兒童，他們分別10歲和16歲。在分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們選擇25個(gè)63號(hào)基因來(lái)進(jìn) 一步研究自閉癥兒童，因?yàn)檫@些基因在皮質(zhì)有穩(wěn)健的協(xié)調(diào)的特異的表達(dá)模式。最終設(shè)置的 25個(gè)標(biāo)記物包括探針，可選擇標(biāo)記一個(gè)或多個(gè)皮層，或標(biāo)記一個(gè)或多個(gè)特異性細(xì)胞型組。獲得尸檢組織我們從兒童的背外側(cè)額部前葉皮質(zhì)上部的或中間的額

7、部腦回，后上部顳部皮質(zhì)或枕部皮 質(zhì)得到的42個(gè)新鮮冰凍尸檢皮質(zhì)組織切片，這些兒童2到15歲，患有自閉癥或沒(méi)有患自閉 癥（控制組）。實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的特殊臨床表型沒(méi)有前置選擇。選擇樣本能代表適合研究的整 體組織，來(lái)自兒童健康和人類發(fā)展國(guó)際組織的腦組織發(fā)育紊亂組，哈佛腦組織資源中心。樣 本通過(guò)了質(zhì)量控制，包括22塊背外側(cè)的額葉前部皮質(zhì)，5塊后上部顳部皮質(zhì)，6塊枕部皮質(zhì)。標(biāo)記物表型研究1每個(gè)背外側(cè)額葉前部皮質(zhì)做連續(xù)冰凍切片（20微米厚），包含所有的板層。這些切片被 分為10組，每組30張切片；24張切片雜交技術(shù)做標(biāo)記，2張用尼斯?fàn)柸旧珌?lái)觀察解剖學(xué)結(jié) 構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析，還有4張未作處理留在將來(lái)用。我們修

8、改實(shí)驗(yàn)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)原位雜交技術(shù) 自動(dòng)高流量輸出并獲得處理尸檢樣本全部載玻片的數(shù)字圖像，這些樣本來(lái)自年輕人出生后的 新鮮的冰凍腦組織。研究2我們連續(xù)切每個(gè)標(biāo)本塊并用原位雜交來(lái)標(biāo)記3個(gè)背外側(cè)的額葉前部皮質(zhì)的標(biāo)本和3個(gè)來(lái) 自女孩的對(duì)照標(biāo)本和來(lái)自男孩的顳部皮質(zhì)標(biāo)本（2個(gè)實(shí)驗(yàn)組、3個(gè)對(duì)照組）和來(lái)自男孩的枕 部皮質(zhì)標(biāo)本（3個(gè)實(shí)驗(yàn)組、3個(gè)對(duì)照組）來(lái)分析5個(gè)基因的表達(dá):CALB1，RORB,PCP4，PDE1A, 和NEFL。這些基因代表基因的一個(gè)亞類，實(shí)驗(yàn)1中經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)在男孩的樣本中表現(xiàn)出強(qiáng) 大的變異。評(píng)估標(biāo)記物的表達(dá)我們給通過(guò)原位雜交獲得的每個(gè)樣本基因所有數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)分：0分正常，1分輕微異常， 2分嚴(yán)重異

9、常。如果我們確定3張切片至少符合如下三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之一的就認(rèn)為是異常的：和對(duì) 照組相比，基因表達(dá)的強(qiáng)度顯示減少或斷裂；和鄰近區(qū)域的數(shù)量比，在標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量中基 因表達(dá)異常歸因于質(zhì)量的改變；或者和對(duì)照組比，基因表達(dá)的特殊細(xì)胞型或?qū)映霈F(xiàn)異常。同 一個(gè)研究人員檢查對(duì)每個(gè)標(biāo)本的每個(gè)切片進(jìn)行評(píng)分，另一個(gè)研究人員在另一個(gè)地方獨(dú)自對(duì)每 個(gè)切片進(jìn)行觀察和積分，他對(duì)第一個(gè)研究人員的計(jì)分毫不知情。然后比較這兩組計(jì)分，比較 它們的一致性。疊加表達(dá)和三維重建為了使基因中異常表達(dá)配準(zhǔn)區(qū)域成像，運(yùn)用PhotoshopCS5（Adobe系統(tǒng)）軟件的多彩 疊加，通過(guò)手動(dòng)調(diào)節(jié)調(diào)整來(lái)記錄和混合一系列原位雜交圖片。制作原位雜交的每張圖的

10、虛假 表達(dá)密度表征，并且對(duì)齊形成一個(gè)插入圖冊(cè)。這些圖冊(cè)納入分子可視工具來(lái)捕捉皮質(zhì)層切片 的完全三維顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表達(dá)分析為了提供自閉癥兒童皮質(zhì)疾病的最初的描述，我們進(jìn)行了原位表達(dá)分析，運(yùn)用大范圍區(qū) 域系統(tǒng)抽樣背外側(cè)額葉前部皮質(zhì)、后上部顳部皮質(zhì)，還有枕部皮質(zhì)進(jìn)行探索性實(shí)驗(yàn)，樣本包 括自閉癥兒童和非自閉癥兒童。對(duì)照組的層狀表達(dá)剖面圖未患病兒童的11個(gè)樣本中檢測(cè)到層狀表達(dá)模式，這和先前研究的未患病成人的結(jié)果類 似，其中一例除外。一個(gè)9歲未患病女孩的標(biāo)本顯示了一個(gè)局部異常點(diǎn)：在背外側(cè)額葉前部 皮質(zhì)的第3、4、5層出現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)6毫米的缺乏符合標(biāo)記物標(biāo)記的斑塊樣區(qū)域。異常層狀表達(dá)模式經(jīng)不同的評(píng)定者鑒定，10

11、/11的局部區(qū)域出現(xiàn)表達(dá)減少或原位雜交的標(biāo)記物的不正常模 式。這些稱作為斑塊的不正常區(qū)域，在一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的標(biāo)記物中長(zhǎng)5到7毫米，有明顯的 邊界。異常標(biāo)簽的描述擴(kuò)展到多個(gè)切片，而且經(jīng)常包括一個(gè)細(xì)胞亞型標(biāo)記物的局部的表達(dá)減 少。從11個(gè)自閉癥兒童的其中3個(gè)，我們觀察到包括標(biāo)記的細(xì)胞密度增加的區(qū)域和斑塊區(qū) 域鄰近。我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)斑塊的4、5層有特殊標(biāo)記物。但是，沒(méi)有那兩個(gè)斑塊的表象完全一樣 的。一個(gè)標(biāo)本中的斑塊有相似的標(biāo)記模式?？紤]到樣本的層和細(xì)胞型非常異常，我們觀測(cè)到 了異質(zhì)性。一個(gè)9歲自閉癥兒童的標(biāo)本清晰地顯示斑塊的表現(xiàn)型，通過(guò)對(duì)一個(gè)直徑5.8毫米 的皮質(zhì)斑塊進(jìn)行多重獨(dú)立標(biāo)記物時(shí)，發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)

12、減少。在兩側(cè)背外側(cè)額葉前部皮質(zhì)和后上顳部皮質(zhì)都有斑塊。3個(gè)樣本的枕部皮質(zhì)或3個(gè)對(duì)照 組組的后上顳部皮質(zhì)或或枕部皮質(zhì)都沒(méi)有異常的表達(dá)模式。層狀缺陷的三維重建為了更好的描述斑塊顯型的完整顯微結(jié)構(gòu)，我們對(duì)斑塊區(qū)域的層狀區(qū)域進(jìn)行了三維重 建，并對(duì)4個(gè)背外側(cè)額葉前部皮質(zhì)的樣本用了 4種不同的標(biāo)記物。這個(gè)方法使原始切片的平 面獨(dú)立分布的標(biāo)記物分布可視，并且確定有多個(gè)標(biāo)記物斑塊區(qū)域緊挨著對(duì)齊。圖3顯示了一 個(gè)自閉癥兒童皮質(zhì)的表層重建，顯示一個(gè)顯著的病理學(xué)斑塊穿過(guò)多層獨(dú)立的標(biāo)記物，和標(biāo)準(zhǔn) 的皮質(zhì)有顯著界限。斑塊區(qū)域的標(biāo)記物表達(dá)興奮皮質(zhì)神經(jīng)元標(biāo)記物的表達(dá)的缺陷是斑塊區(qū)域最有效的指示物，盡管在四個(gè)細(xì)胞特異 型組中

13、有三個(gè)已經(jīng)被確認(rèn)為異常情況。標(biāo)記物由5個(gè)自閉癥候選基因編碼，和大多數(shù)檢驗(yàn)過(guò) 的樣本比，這些基因顯示輕微的斑塊異常。大多數(shù)中間神經(jīng)元顯示輕微的異常，這在實(shí)驗(yàn)組 樣本中存在不一致，也有少數(shù)例外，相對(duì)出現(xiàn)在未患自閉癥組的分析中。有一個(gè)例外（12號(hào)病人的SLC1A2），特異性膠質(zhì)標(biāo)記物在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同的皮質(zhì) 區(qū)域顯示相同的標(biāo)記模式，包括在用其他標(biāo)記物的異常斑塊中。這個(gè)發(fā)現(xiàn)支持了斑塊的特征 不屬于主要的基因表達(dá)的減量調(diào)節(jié)的假設(shè)。神經(jīng)元的密度沒(méi)有減少為了確定多基因異常表達(dá)是否由于分散區(qū)域的神經(jīng)元的數(shù)量的減少，我們?cè)诓∪怂篮笥?無(wú)目的的使用尼氏染色切片相鄰的呈現(xiàn)在背外側(cè)前額葉皮層斑塊部分進(jìn)行體視密度測(cè)量

14、。我 們最少通過(guò)5個(gè)尼氏切片測(cè)量每個(gè)樣本的兩個(gè)區(qū)域的全部的板層神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的密度， 這些切片最少包括3毫米的皮質(zhì)。我們觀察到很小但很有意義的是和對(duì)照組相比，斑塊區(qū)域 的平均神經(jīng)元密度有增大（P=0.01）。實(shí)驗(yàn)組中，和鄰近區(qū)域比較，斑塊區(qū)域的平均神經(jīng)元 密度增大，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.10）。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們推斷，局部斑塊區(qū) 域并不是神經(jīng)元數(shù)量減少的結(jié)果。檢查結(jié)果的定量驗(yàn)證我們進(jìn)行定量的RT-PCR分析來(lái)驗(yàn)證原位雜交半定量檢查結(jié)果。從用來(lái)研究的第4組有 最嚴(yán)重斑塊的樣本中檢查出來(lái)額外的組織塊。在這些樣本中，我們進(jìn)一步確定了一個(gè)嚴(yán)重的 斑塊和一個(gè)輕微的斑塊。重點(diǎn)是嚴(yán)重斑塊的那一

15、組，我們通過(guò)原位雜交指導(dǎo)用激光捕捉顯微 解剖來(lái)分離斑塊和鄰近感興趣區(qū)域，并用PT-PCR分析CALB1的信使RNA的轉(zhuǎn)錄水平。 和原位雜交得到的結(jié)果一致的是，我們觀察到和鄰近區(qū)域相比，孤立斑塊的C ALB1信號(hào)顯 著減少。討論為特殊細(xì)胞亞型和自閉癥候選基因亞型用大量高選擇性的標(biāo)記物，我們檢測(cè)到不連續(xù)的 異常層狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病理學(xué)斑塊，在額葉前部和顳部的皮質(zhì)大量分析樣本中發(fā)現(xiàn)有裂解，但 是枕部的皮質(zhì)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，樣本來(lái)自我們研究涉及的患有自閉癥的男孩和女孩。連續(xù)的分析和 多重細(xì)胞標(biāo)記物的三維重建顯示，這些基因異常表達(dá)的局部斑塊長(zhǎng)5到7毫米，并跨過(guò)多重 連續(xù)的大腦新皮質(zhì)層。這些斑塊有一下特征：細(xì)胞表達(dá)層

16、數(shù)目減少，特異細(xì)胞型標(biāo)記物在完 全分化的皮質(zhì)神經(jīng)元中正常存在，某些自閉癥候選基因的表達(dá)減少。樣本中斑塊的顯示是一致的，但在整個(gè)樣本中有是不一樣的。沒(méi)有皮質(zhì)層均勻的多余， 異常表達(dá)的明顯的證據(jù)在第4、5層。標(biāo)記物表達(dá)減少不是因?yàn)樯窠?jīng)元數(shù)量的減少；斑塊中 未標(biāo)記神經(jīng)元的身份任然不能確定。這些神經(jīng)元可能是沒(méi)有表達(dá)標(biāo)記物的層合適神經(jīng)元，或 是處在幼稚或擾亂發(fā)育的狀態(tài)的神經(jīng)元，或者是層不適合神經(jīng)元。我們的數(shù)據(jù)和早期出生前 起源或至少出生前發(fā)展的，可以認(rèn)為有自閉癥傾向的數(shù)據(jù)一致。盡管我們的數(shù)據(jù)提出了一個(gè)新奇的自閉癥的病理學(xué)機(jī)制，但是他們不能鑒別這個(gè)機(jī)制。 被鑒定的層狀裂解可能由于細(xì)胞未能達(dá)到特定的目的地產(chǎn)

17、生的移動(dòng)缺陷和鄰近區(qū)域的細(xì)胞 的積累造成的，如已經(jīng)在小鼠遷移模型中看到的那樣?；蛘?，斑塊可以反應(yīng)早期神經(jīng)發(fā)育過(guò) 程中潛在的基因序列和表觀遺傳狀態(tài)從頭到尾的變化，這些產(chǎn)量斑塊區(qū)域鄰近未受影響的祖 細(xì)胞區(qū)域的受影響的祖細(xì)胞。為了檢驗(yàn)任意一個(gè)模型，需要來(lái)自自閉癥兒童的大腦新皮質(zhì)組 織大區(qū)域的定量分析，來(lái)詳細(xì)的比較基因序列，甲基化狀態(tài)和皮質(zhì)斑塊確定區(qū)域的表達(dá)剖面 圖，和沒(méi)有斑塊的區(qū)域作比較。盡管我們沒(méi)有預(yù)選特殊的臨床表型，但是我們?cè)?0/11的樣本中和1/11的對(duì)照組中確定 了病理學(xué)皮質(zhì)斑塊。因?yàn)槲覀兊拿總€(gè)樣本幾乎都是觀察到的局部斑塊的一小部分，最牽強(qiáng)的 解釋是病理學(xué)斑塊廣泛分布在自閉癥兒童的額葉前部

18、皮質(zhì)和顳部皮質(zhì)。鑒于自閉癥中很好描 述的表現(xiàn)型異質(zhì)性，樣本中相對(duì)相似的病理學(xué)特征的存在也是不希望看到的。然而，我們描 述的特征可能解釋一些自閉癥的特異性表現(xiàn)型:額葉前部和顳部皮質(zhì)的不同部位的破裂的斑 塊能中段不平等的功能系統(tǒng)，并潛在的影響癥狀的表達(dá)、治療的反應(yīng)和臨床結(jié)果。從這個(gè)模 型中對(duì)照組中相似斑塊的觀察結(jié)果同樣升高了亞臨床斑塊表現(xiàn)型的可能性。我們沒(méi)有觀察到斑塊中標(biāo)記物表達(dá)明顯的異常，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星型神經(jīng)膠質(zhì)一樣， 結(jié)果表明原位信號(hào)的缺乏不是非特異性組織或通常情況下影響信使RNA的完整性的處理的 人工制品。原位雜交指導(dǎo)的特殊RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)我們最初方發(fā)現(xiàn)的在信號(hào)方面而不 是處理過(guò)程的偽跡上斑塊區(qū)域定量的減少。這里用的原位雜交的標(biāo)準(zhǔn)化的高流通量的色度法的強(qiáng)度是通過(guò)大的基因組的標(biāo)簽的再 現(xiàn)性和標(biāo)記連續(xù)薄的切片的表達(dá)細(xì)胞胞體的方法的敏感性。這種方法廣泛應(yīng)用在大鼠大腦基 因轉(zhuǎn)錄物分布的全基因組測(cè)繪，而且定向分析非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的大腦組織。我們的實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)由