菌種傳代、使用、保存操作規(guī)程

1、目的本文件規(guī)定了微生物檢驗用菌、無菌檢驗用菌及抗生素檢驗用菌的接種、保存，傳代方法及 要求，適用于中心化驗室進(jìn)行檢驗用菌的接種和傳代操作。適用范圍適用于中心化驗室菌種管理人員進(jìn)行檢驗用菌的接種、保存和傳代操作。職責(zé)菌種管理人員應(yīng)按本程序的規(guī)定操作。參考文件及相關(guān)程序B08(02)005微生物實驗室標(biāo)準(zhǔn)管理程序B08(02)019微生物檢驗用菌標(biāo)準(zhǔn)管理程序B08(02)020檢驗用培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)管理程序程序?qū)φ站昝Q金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26 003.銅綠假單胞菌CMCC(B) 10 104生孢梭菌CMCC(B) 64 941枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63 501大腸埃希菌CMCC(B)

2、 44 102白色念珠菌CMCC(F) 98 001.黑曲霉CMCC(F) 98 003短小芽孢桿菌CMCC(B) 63 202藤黃微球菌CMCC(B) 28 001乙型副傷寒沙門菌CMCC(B) 50 094菌種來源中國藥品生物制品檢定所提供的冷凍干燥菌種(即安甑)。微生物檢驗用菌菌懸液的制備5.3.1.菌種的復(fù)蘇與傳代復(fù)蘇菌取備妥的冷凍菌種安甑，滅菌的毛細(xì)滴管、雙碟、鑷子、注射器、滅菌水及 種所需的培養(yǎng)基等物品，移入超凈工作臺。復(fù)蘇菌用75%酒精棉球擦凈冷凍菌種安甑外壁，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將安甑的封口一端在火焰上燒灼，用滅菌毛細(xì)管吸取滅菌水或胰酪大 豆胨液體培養(yǎng)基少許在灼熱

3、處，使其驟冷，用干燥無菌紗布包裹安甑，安甑掰開。在不離開火焰圈內(nèi)，迅速用注射器抽取約0.5ml胰酪大豆胨瓊液體培養(yǎng)基，注入安甑內(nèi)，輕輕震搖使冷凍菌塊溶解、混勻，隨即用注射器吸取安甑內(nèi)容物分別接種至1支胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，1支普通胰酪大豆胨胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)基內(nèi)。5.3.1.5將接種后的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基以及胰酪大豆胨胰酪大豆胨瓊脂斜面置3035。恒溫培養(yǎng)1824小時。（接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、乙 型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035。恒溫培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培

4、養(yǎng)物至沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng) 基上，2328。恒溫培養(yǎng)2448小時；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊 脂斜面上，2328 C恒溫培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05%聚山梨酯80的0.9% 無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫制成孢子懸液。）取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)，如無雜菌，轉(zhuǎn)接至2支普通胰酪大豆胨瓊脂斜面中，于3035 C恒溫培養(yǎng)1824小時，同時作平板分離單個菌落及涂片鏡檢。鏡檢呈典型的菌型后，取第1支用滅菌0.9%氯化鈉溶液洗下菌苔，加液體石蠟（液體石蠟最終濃度為10% ），分裝至凍存管中（凍存管1ml/支）于W-30C條件下冷凍保存；第2支接種至胰酪大豆胨瓊液體培養(yǎng)基中

5、，置3035 C恒溫培養(yǎng)1824小時，分裝至凍存管中（凍存管1ml/支），加入液體石蠟，于W -30C條件下冷凍保存，作為工作用試驗菌種（也稱為工作用菌種）。每次傳代應(yīng)作好記錄，工作菌種的標(biāo)簽除標(biāo)明菌種名稱外，還應(yīng)表明菌種編號，傳 代次數(shù)，傳代日期，傳代人，支數(shù)（凍存管編號 DC02-1211-1-3-01，表示大腸埃希 菌2012年11月購買的第一支菌種第3代1號凍存管；復(fù)蘇菌液編號 DC02-1211-1-3-01-00，表示大腸埃希菌 2012年11月購買的第一支菌種第 3代1 號管復(fù)蘇后的菌液，其中 DC02表示大腸桿菌）。每半年應(yīng)對凍存管中每種菌的菌種生長情況進(jìn)行一次復(fù)核試驗，并記錄

6、。5.4.斜面接種法接種前用紫外光照射30分鐘以上，并用75%酒精棉球擦拭超凈工作臺進(jìn)行滅菌。準(zhǔn)備好需用的培養(yǎng)基斜面，標(biāo)簽上注明菌種名稱和接種日期。培養(yǎng)基的制備日期應(yīng)在2周之內(nèi)，如斜面已無凝水者不宜再用。自冰箱中取出菌種斜面，在室外溫下放置約20分鐘，待溫度與室溫平衡后，再移入超凈工作臺。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管斜面的棉花塞，通過火焰轉(zhuǎn)動使稍稍松動，以便接種時易于拔?。粸榉乐辜?xì)菌污染，接種操作應(yīng)在搪瓷方盤上方進(jìn)行，以防止細(xì)菌微粒散落。再將原來已有的菌種斜面培養(yǎng)基（簡稱菌種管）與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基（簡稱接種 管），持在左手拇指、食指及中指之間，要注意能清楚觀察到斜面，使菌種管在前，接 種管在后。

7、應(yīng)斜持使管呈 45度角，使試管內(nèi)斜面向上，兩試管口平齊，注意不要持成 水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。右手持接種環(huán)的柄端，垂直或稍斜地把接種環(huán)置于火焰上（酒精燈外焰）燒灼至燒紅約 30秒，以徹底滅菌，隨后將全部鉑金絲及金屬棒部分在火焰上燒灼，接種柄一邊轉(zhuǎn)動， 一邊慢慢地來回通過4次，燒灼時，應(yīng)把接種環(huán)置于酒精燈的外焰上。使用右手的小指和手掌之間以及無名指與小指之間，在火焰旁分別拔出兩支試管的棉塞并夾住棉塞，左手將試管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼以殺死管口可能沾污的細(xì)菌，但勿燒燙。用右手的拇指、食指和中指操作接種環(huán)，將灼燒過的接種環(huán)的鉑金耳伸入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基，如有熔印，則表明接種環(huán)

8、未冷卻，能燙死細(xì)菌。一定待冷卻 到室溫后，方可從斜面上挑取菌苔少許，隨即取出時接種環(huán)，在火焰旁迅速插入接種管，在斜面上輕輕劃線接種，劃線時一般先由下而上劃一直線后，再由下而上劃“s形曲線。操作過程應(yīng)迅速，勿使菌種沾至管壁或管口，只能劃動一次，切勿重復(fù)移動。如需同時 接種幾支菌種斜面時，刮一次菌苔后可以連續(xù)接各三支斜面。從菌種管中取出接種環(huán)，立即將管口通過火焰滅菌，用右手在火焰旁將菌種管及接種管 的棉塞堵上，不要將管口離開火焰旁去迎接右手的棉塞；然后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅 菌，應(yīng)先將鉑金耳離沾有細(xì)菌遠(yuǎn)端的鉑金絲燒灼至紅，使其傳熱至鉑金耳使鉑金耳上殘留的菌苔漸枯焦、炭化后，才將鉑金耳移至火焰中燒灼

9、至紅約30秒（不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間），再消毒接種環(huán)的金屬部分，使其在火焰 上燒灼通過3次。當(dāng)接種完畢后，將接種后的普通胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌在 30 35C培養(yǎng)1824小時，真菌在2328C培養(yǎng)2448小時。取出，置室溫約 1小時， 待溫度與室溫平衡后放入冰箱（28 C）內(nèi)保存，并定期進(jìn)行傳代和接種（菌種斜面每1個月用普通胰酪大豆胨瓊脂斜面?zhèn)鞔淮?，芽孢桿菌每3個月用普通胰酪大豆胨瓊脂斜面?zhèn)鞔淮?，菌種傳代不超過5代）。工作用菌種（凍存管）的使用接種前用紫外光照射30分鐘以上，并用75%酒精棉球擦拭超凈工作臺進(jìn)行滅菌。準(zhǔn)備好 適宜的培養(yǎng)基，標(biāo)簽

10、上注明菌種名稱和接種日期。自冰箱中取出菌種凍存管，在培養(yǎng)箱復(fù)蘇約60分鐘，待解凍后，移入超凈工作臺。 點(diǎn)燃酒精燈，用無菌注射器吸出菌液，接種至培養(yǎng)基中，3035C培養(yǎng)1824小時。將上述培養(yǎng)物吸出1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液逐級稀釋，制成每 1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液，備用。（菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在 28C可在24小時內(nèi)使用。)無菌檢查用菌菌懸液的制備按5.3中的工作用菌種凍存管接種方法操作，接種好所需的對照菌株凍存管分別接種至營養(yǎng) 瓊脂培養(yǎng)基斜面及胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，將接種后的胰酪大豆胨瓊脂斜面及胰酪大豆胨液體置3035。恒溫培養(yǎng)1824小時。取出培

11、養(yǎng)物，仔細(xì)觀察斜面菌苔形態(tài)，確認(rèn)無雜菌。(接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌至 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035。恒溫培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基上，2328。恒溫培養(yǎng)2448小時)金黃色葡萄球菌菌液：取金黃色葡萄球菌的胰酪大豆胨液體新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含菌10100個。銅綠假單胞菌菌液：取銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨液體新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含菌10100個。生孢梭菌菌液：取生孢梭

12、菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含菌10100個?？莶菅挎邨U菌菌液：取枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含菌10100個。大腸埃希菌菌液：取大腸埃希菌的胰酪大豆胨液體新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含菌10100個。白色念珠菌菌液：取白色念珠菌的沙氏葡萄糖培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10100個菌。黑曲霉：取黑曲霉菌的凍存管1支，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面， 在2328C培養(yǎng)5 7天，加入35ml含0.05% (ml/ml )

13、聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。移至無菌試管內(nèi)，用含 0.05% (ml/ml )聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10100個菌。抗生素微生物菌懸液的制備按5.3中的工作用菌種凍存管接種方法操作，接種好所需的對照菌株凍存管。枯草芽孢桿菌懸液：取枯草芽孢桿菌凍存管1支接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基瓶中，在3537 C培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，65 C加熱30分鐘，備用。短小芽孢桿菌懸液：取短小芽孢桿菌凍存管1支接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基瓶中，在3537 C培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗

14、下，65 C加熱30分鐘，備用。藤黃微球菌懸液：取藤黃微球菌懸液凍存管1支接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基瓶中，在2627 C培養(yǎng)24小時，用0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。5.8.菌種的保存工作用菌種（凍存管）置于W-30C條件下冷凍保存。菌種斜面置于28C保存。菌懸液置于28C保存。6.環(huán)境保護(hù)、健康、安全接種完畢后，應(yīng)立即用消毒酒精擦拭臺面，并用紫外燈照射30分鐘以上，防止污染。菌液及帶菌器具應(yīng)及時放入濕熱蒸汽滅菌器中121C滅菌30min后再清洗。在接種進(jìn)程中，如果棉塞因不慎著火，切勿用口吹，必須在剛剛著火時，迅速將棉塞塞入試 管，使棉塞在試管內(nèi)因氧氣不足而很快熄滅。灼燒帶菌接種環(huán)時，不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間及操作人員。如在操作過程中，不小心使細(xì)菌濺落，應(yīng)立即用消毒酒精擦拭被染部位，以防止污染。假定實驗工作衣受污染，應(yīng)立即脫下翻轉(zhuǎn)包裹，使污染部分包在內(nèi)部，送往消毒，經(jīng)滅菌處理后，再 洗滌滅菌處理后用。因偶然打破盛有培養(yǎng)物的器皿，致使病原性的菌毒種外溢，污染了工作室及操作者的衣物及體表時， 當(dāng)事人應(yīng)冷靜，切勿亂動以免擴(kuò)大污染面。應(yīng)喚他人用浸透消毒液的毛巾或紗布覆蓋于碎片上，或?qū)?消毒液2%的甲酚皂或0.2%的新潔爾滅溶液）倒在污染區(qū)，浸沒一段時間。先從