原生質(zhì)體培養(yǎng)以及體細(xì)胞雜交

1、關(guān)于原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交第1頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四(1)了解原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義；(2)掌握原生質(zhì)體分離的大致步驟； (3)掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法；(4)掌握原生質(zhì)體融合的方湊。 第7章 原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細(xì)胞雜交本章教學(xué)目的與要求第2頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四 原生質(zhì)體（Protoplast）含義：去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細(xì)胞。第7章 原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細(xì)胞雜交第3頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四微 絲葉綠體線粒體質(zhì) 膜細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微 管細(xì)胞壁高爾基體植物細(xì)胞模式圖第7章 原生質(zhì)體培

2、養(yǎng) 與和體細(xì)胞雜交液 泡第4頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化一、原生質(zhì)體分離雙子葉外植體胚性細(xì)胞第7章 原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細(xì)胞雜交第5頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料-葉肉細(xì)胞。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化（一）材料來(lái)源禾本科植物： 愈傷組織或懸浮細(xì)胞。第6頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化（二） 分離方法機(jī)械分離法酶法分離法第7頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四1、機(jī)械分離法（Machanical isolation

3、）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化優(yōu)點(diǎn)：（1）能排除酶的有害影響；缺點(diǎn)：（1）原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；（2）方法繁瑣費(fèi)力；（3）局限性大第8頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四（1）酶的種類(lèi)纖維素酶類(lèi)（Cellulase） 果膠酶類(lèi)（Pectolyase）半纖維素酶類(lèi)（Hemicellulase）崩潰酶蝸牛酶2、酶法分離（Enzymatic isolation）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化第9頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四（2）酶液的配制第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化滲透壓穩(wěn)定劑及pH酶的配比及濃度第10頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四

4、（3）分離原生質(zhì)體第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化兩步分離法一步分離法方法有二：葉肉原生質(zhì)體分離提純第11頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四圖示原生質(zhì)體分離過(guò)程（以葉片為例）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化過(guò)濾、離心加果膠酶和纖維素酶第12頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化葉片愈傷組織第13頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四二、 原生質(zhì)體純化與活力測(cè)定（一）原生質(zhì)體純化第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化方法三種離心沉淀法漂浮法界面法第14頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四1、 離心沉淀法原理：

5、應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：第一步原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過(guò)濾。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此2-3次。第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化第15頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四2、漂浮法原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網(wǎng)篩過(guò)濾。第二步：離心。第三步：吸去上清液，洗滌液重懸，離心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1次。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化第16頁(yè)

6、，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四 3 、 界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化第17頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四（二） 原生質(zhì)體活力測(cè)定1、形態(tài)識(shí)別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。2、染色識(shí)別1）0.1%酚番紅或Evans藍(lán)染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離 及純化第18頁(yè)，共4

7、1頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四第二節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)一、培養(yǎng)基pH滲透壓鈣鎂生長(zhǎng)物質(zhì)氮源碳源培養(yǎng)基第7章 原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細(xì)胞雜交第19頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四二、培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第20頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四1、液體淺層培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體懸浮液1mm厚液體培養(yǎng)基2x105/ml第21頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四2、平板培養(yǎng) 原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37C左右）等體積混合成0.

8、7% ，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第22頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四3、雙層培養(yǎng)法（固、液培養(yǎng)） 培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進(jìn)行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第23頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法一：X-射線殺死原生質(zhì)體，與生活力正常的原生質(zhì)體混合，加入0.7%瓊脂，制成混合液，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第24頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四方法二：X-射線殺死原生質(zhì)體，與0.7%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與0

9、.7%瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第25頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四定義：原生質(zhì)體融合也叫做體細(xì)胞雜交，使分離出來(lái)的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。第7章 原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細(xì)胞雜交第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第26頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四一、原生質(zhì)體融合意義克服雜交不親合克服生殖器官敗育克服柑桔多胚第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第27頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四二、融合方法 無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)融合 高pH-高Ca離子 聚乙二醇(PE

10、G)法 PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法 電融合技術(shù)第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第28頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四(一)無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)融合: NaNO3法1972年： Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種。NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第29頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四 1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶液在37時(shí)，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。優(yōu)點(diǎn)：雜種產(chǎn)量高。不足：高pH值對(duì)細(xì)胞有毒害作用。第三節(jié)、原生

11、質(zhì)體融合（二）高pH-高Ca離子法第30頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四PEG法特點(diǎn)：融合頻率高可重復(fù)性強(qiáng)誘發(fā)融合無(wú)特異性毒性較低植物+植物植物+動(dòng)物動(dòng)物+酵母第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（三）PEG法第31頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四PEG法原理PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過(guò)程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊(duì)導(dǎo)致一個(gè)原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第32頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5

12、月20日，2點(diǎn)47分，星期四最為常用。具體做法：在無(wú)菌條件下混合雙親原生質(zhì)體-滴加PEG溶液，搖勻，靜置-滴加高鈣-高pH溶液，搖勻，靜置-滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次-離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)-篩選-再生雜合細(xì)胞第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（四）PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法第33頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四(五)電融合技術(shù)Senda 1979年首先用此方法實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第34頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四三、體細(xì)胞雜種細(xì)胞篩選與鑒定1互補(bǔ)選擇法第三節(jié)、原生質(zhì)體融合2、機(jī)械分離雜種細(xì)胞法3. 雙熒光標(biāo)記選擇法第35頁(yè)，共41頁(yè)，2

13、022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四異硫氰酸熒光素（FITC）：綠色異硫氰酸羅丹明（RITC）：紅色3. 雙熒光標(biāo)記選擇法第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第36頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四四、體細(xì)胞雜種植株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定 細(xì)胞學(xué)觀察 DNA內(nèi)切圖譜分析 同工酶分析第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第37頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四(1) 原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：(1)再生植株； (2)用于遠(yuǎn)緣體細(xì)胞融合，進(jìn)行體細(xì)胞雜交。(2) 原生質(zhì)體分離方法：機(jī)械分離法、酶法分離。 (3)酶的種類(lèi)及特點(diǎn)(4)原生質(zhì)體的純化方法：離心沉淀法；漂浮法；界面法。(5)原生質(zhì)體活力的測(cè)定：形態(tài)識(shí)別；染色識(shí)別。第7章 原生質(zhì)體培養(yǎng) 與和體細(xì)胞雜交本章小結(jié)：第38頁(yè)，共41頁(yè)，2022年，5月20日，2點(diǎn)47分，星期四（6）原生質(zhì)體培養(yǎng)方法：液體淺層培養(yǎng)；平板法培養(yǎng)；懸滴法培養(yǎng)；雙層培養(yǎng)法；飼喂層培養(yǎng)（7）原生質(zhì)體融合的方法：無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)融合；聚乙二醇與高pH高鈣相結(jié)合的誘導(dǎo)融合；電融合技術(shù)。（8）雜種細(xì)胞的