柱后衍生原理和關(guān)鍵點

1、上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司上海市乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心()中國上海江場西路1550號3號樓 網(wǎng)址：1氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生簡介及關(guān)鍵點主講：何亞斌2012.072衍生化的定義衍生化是一種利用化學(xué)變換把化合物轉(zhuǎn)化成類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。一般來說，一個特定功能的化合物參與衍生反應(yīng)，溶解度，沸點，熔點，聚集態(tài)或化學(xué)成分會產(chǎn)生偏離。由此產(chǎn)生的新的化學(xué)性質(zhì)可用于量化或分離。 3衍生化的目的衍生化最為主要的目的就是提高目的物的可檢測性。把難于分析的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似但易于分析的物質(zhì)，便于量化和分離。 對于GC來講，多數(shù)是為了增強目的物揮發(fā)性或者改善目的物極性;對于HPLC

2、來講多數(shù)是為了提高檢測器對目的物的響應(yīng)。衍生化常用的反應(yīng)有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等4衍生化試劑簡單的說:它能幫你將不能分析的樣品通過衍生化試劑反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可分析的化合物.種類:烷基化試劑、硅烷化試劑、酰化試劑類、熒光衍生化試劑、 紫外衍生化試劑、苯甲酰氯為衍生化試劑、羥基衍生化試劑 、 手性衍生化試劑、氨基衍生化試劑。5判斷衍生化反應(yīng)的指標 1、反應(yīng)是否迅速、定量進行，反應(yīng)重復(fù)性好壞，反應(yīng)條件是否溫和，是否容易操作。2、反應(yīng)選擇性高，最好只于目標化合物反應(yīng)。3、衍生化產(chǎn)物只有一種，反應(yīng)的副產(chǎn)物和過量的衍生化試劑應(yīng)不干擾目標化合物的分離和檢測。4、衍生化試劑通用性好，價廉

3、易得。6衍生化方法應(yīng)用不當(dāng)?shù)谋锥?、柱上衍生化可能損傷色譜柱。 2、某些衍生化試劑需氮氣吹干。 3、衍生化不完全，影響靈敏度。4、衍生化試劑不當(dāng)，產(chǎn)物分子量過大。7衍生化分類1. 從是否形成共價鍵來說，可分為：標記和非標記反應(yīng)。標記反應(yīng)是在反應(yīng)過程中，被分析物與標記試劑之間生成共價鍵；所有其它類型的反應(yīng)，如形成離子對、光解、氧化還原、電化學(xué)反應(yīng)等都是非標記反應(yīng)。82.從衍生反應(yīng)的場所來說，可分為：柱前衍生化(pre-columnderivatization)；柱上衍生化(on-columnderivatization)；柱后衍生化(post-columnderivatization)三種。3.

4、從是否與儀器聯(lián)機的角度來分有：在線(on-line)、離線(off-1ine)和旁線(at-line)(自動化)三種。目前在HPLC中以離線的柱前衍生法(簡稱柱前衍生法)與在線的柱后衍生法(簡稱柱后衍生法)使用居多，旁線衍生化方法是發(fā)展方向。9柱前衍生和柱后衍生定義柱前衍生是在經(jīng)過分析柱前使分析物與衍生劑反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在分析柱上實現(xiàn)分離，實際分離的是衍生產(chǎn)物，檢測的也是衍生產(chǎn)物;柱后衍生是分離物在分析柱中實現(xiàn)分離后，在衍生池內(nèi)與衍生劑反應(yīng)，在柱子中分離的是目的物，在檢測器處檢測的衍生產(chǎn)物。10柱前衍生法的優(yōu)缺點優(yōu)點：相對自由地選擇反應(yīng)條件；不存在反應(yīng)動力學(xué)的限制；衍生化的副產(chǎn)物可進行預(yù)處理以降

5、低或消除其干擾；容易允許多步反應(yīng)的進行；有較多的衍生化試劑可選擇；不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。缺點：形成的副產(chǎn)物可能對色譜分離造成較大困難；在衍生化過程中，容易引入雜質(zhì)或干擾峰，或使樣品損失。11柱后衍生的優(yōu)缺點優(yōu)點：形成副產(chǎn)物不重要，反應(yīng)不需要完全，產(chǎn)物也不需要高的穩(wěn)定性，只需要有好的重復(fù)性即可；被分析物可以在其原有的形式下進行分離，容易選用已有的分析方法。缺點：對于一定的溶劑和有限的反應(yīng)時間來說，目前只有有限的反應(yīng)可供選擇；需要額外的設(shè)備，反應(yīng)器可造成峰展寬，降低分辨率。12柱后衍生技術(shù)的應(yīng)用 氨基酸；鏈霉素以及其他氨基糖苷類抗生素，包括：慶大霉素、阿泊拉霉素、新霉素等。氨基甲酸酯：涕滅威亞砜、

6、涕滅威砜、草氨酰、滅多蟲、3-羥基呋喃丹、涕滅威、殘殺威、呋喃丹、 西維因（胺甲萘）、1-萘酚、滅蟲威、BDMC內(nèi)標草甘磷以及百草枯、敵草快等除草劑黃曲霉毒素等毒素。其它應(yīng)用：聚醚抗生素、串珠鐮孢毒素、貝毒等毒素、單端孢莓稀毒枝菌素和赭曲霉 毒素、生物胺、甲醛、類固醇等。13如何實現(xiàn)柱后衍生1415衍生試劑16原理17氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生原理氨基甲酸酯類農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)中均含有下N-甲基氨基甲?；?81920氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生氨基甲酸酯類農(nóng)藥按照在C18、 C8柱上的洗脫順序流出。分離后的氨基甲酸酯農(nóng)藥首先在100下在NaOH作用下水解釋放出醇，碳酸鹽和甲胺。在第二個柱后反應(yīng)中甲胺與

7、鄰苯二甲醛（OPA和2-巰基乙醇反應(yīng)生成有強熒光吸收的1-甲基-2-蚓哚類化合物，被熒光檢測器檢測且具有很低的檢測限，滿足殘留分析方法的要求。 21氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生原理22氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生柱后衍生系統(tǒng)圖23氨基甲酸酯類農(nóng)藥的柱后衍生氨基甲酸酯分析的柱后條件： 衍生試劑1：水解衍生試劑CB 130 衍生試劑2：100mg OPA, 2g Thiofluor溶解于950mL CB 910 反應(yīng)器1：100，0.5mL 反應(yīng)器2：環(huán)境溫度 衍生試劑流速：0.3mL/min 檢測條件：熒光檢測器：ex 330nm , em 465nm 氨基甲酸酯分離柱（4.6250mm）, C18

8、, 5um 24反應(yīng)試劑的準備OPA衍生試劑水解試劑25反應(yīng)試劑的準備 1.水解試劑 用甲醇徹底清洗兩個反應(yīng)試劑瓶，并用甲醇清洗浸在反應(yīng)試劑中的管線。 水解試劑不需要制備，直接將水解試劑(CB 930)倒入到標有水解試劑標簽的反應(yīng)試劑瓶中。注！水解試劑不建議自己制備，因為很難得到足夠純度的NaOH 。 26反應(yīng)試劑的準備2. OPA試劑 a. 倒入945mL OPA稀釋劑（CB 910）到反應(yīng)試劑瓶中（留下5mL備用）。 b. 蓋上瓶蓋，打開Vent閥，打開氣源，用惰性氣體鼓泡至少10分鐘。 c. 溶解100mg OPA到大約10mL HPLC級甲醇中。 d. 關(guān)閉氣源，移走瓶蓋，加入OPA溶

9、液到已經(jīng)脫氧的OPA稀釋劑瓶中。 e. 溶解2g Thiofluor (Cat. No. 3700-2000)到剛才剩下的5mL OPA稀釋劑中，然后加入到反應(yīng)試劑中。 f. 蓋上瓶蓋并打開氣源，連續(xù)鼓泡1min。輕搖試劑瓶直到完全混合。 27注意!如果沒有Thiofluor(N,N-二甲基-2-巰基乙胺鹽酸鹽)，移取1mL 2-巰基乙醇。處理2-巰基乙醇應(yīng)該在通風(fēng)櫥內(nèi)進行，因其易揮發(fā)和不愉快的臭味。不推薦自己制備OPA稀釋劑，因為硼酸鈉（任何級別）含有過量的重金屬和不溶物，這些雜質(zhì)最終會沉淀在反應(yīng)器和流通池內(nèi)。水解試劑比較穩(wěn)定，而OPA試劑易于氧化且一直降解。在惰性氣體體密封下，OPA試劑可以維持兩周而沒有明顯的活性降低。 28清洗系統(tǒng)衍生試劑換成水沖洗管路30min；反應(yīng)池溫度設(shè)為小于60；將水換成水/甲醇（80/20）溶液，再沖洗30min