熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用課件

1、熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用熒光免疫測定的應(yīng)用熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用熒光免疫技術(shù)基本原理 采用熒光素標(biāo)記抗體與組織或細(xì)胞抗原反應(yīng)，經(jīng)過洗滌分離后，熒光顯微鏡下觀察呈特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位，借此對組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測定，又稱熒光抗體技術(shù)。熒光免疫技術(shù)基本原理 采用熒光素標(biāo)記抗體與組 利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。 熒光顯微鏡原理 利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用課件采用熒光素標(biāo)記抗體與組織或細(xì)胞抗原反應(yīng)，

2、經(jīng)過洗滌分離后，熒光顯微鏡下觀察呈特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位，借此對組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測定，又稱熒光抗體技術(shù)。測定：抗病毒抗體、細(xì)菌和毒素抗原、激素、腫瘤標(biāo)志物等德國產(chǎn)品（Schott）BG12 、中國產(chǎn)品QB24 、有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530 、濾板完全以數(shù)字命名，如 Corning廠的NO：5-58測定：蛋白質(zhì)、激素、藥物、腫瘤標(biāo)記物、 病原體抗原/抗體等熒光激發(fā)光源1000次/S激發(fā)，比活性提高汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動(dòng)載玻片厚度應(yīng)在0.8、使用阻斷濾片(目前多數(shù)阻斷濾片內(nèi)置于熒光顯微鏡)有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的

3、用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。2、打開高壓汞燈的電源控制箱開關(guān)。鑭系元素壽命長:10s1000s 熒光顯微鏡的裝置一、光源現(xiàn)在用高壓汞燈作光源 二、濾色系統(tǒng) （激發(fā)濾板和壓制濾板）德國產(chǎn)品（Schott）BG12 、中國產(chǎn)品QB24 、有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530 、濾板完全以數(shù)字命名，如 Corning廠的NO：5-58 三、反光鏡反光鏡的反光層一般是鍍鋁的 四、聚光鏡 （明視野聚光器 、暗視野聚光器和相差熒光聚光器）采用熒光素標(biāo)記抗體與組織或細(xì)胞抗原反應(yīng)，經(jīng)過洗滌分離后，熒光 五、物鏡 各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡 六、目鏡在熒光顯微

4、鏡中多用低倍目鏡，如5和6.3 七、落射光裝置 五、物鏡 透射熒光顯微鏡光路落射熒光顯微鏡光路 透射熒光顯微鏡光路落射熒光顯微鏡光路熒光顯微鏡的操作1、安裝紫外防護(hù)罩。2、打開高壓汞燈的電源控制箱開關(guān)。3、插入擋光板，中斷光路。4、預(yù)熱510分鐘。5、將載有樣品的載玻片放到載物臺(tái)上。6、選擇接物鏡(按照先低倍，后高倍順序)。7、旋轉(zhuǎn)分光鏡組件轉(zhuǎn)盤，選擇所需要的分光鏡組件8、使用阻斷濾片(目前多數(shù)阻斷濾片內(nèi)置于熒光顯微鏡)9、通過粗、細(xì)螺旋調(diào)整焦距。10、打開與顯微鏡連接的計(jì)算機(jī)，點(diǎn)擊數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件，采集數(shù)碼圖像。熒光顯微鏡的操作1、安裝紫外防護(hù)罩。 國產(chǎn)高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以

5、代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡，平均壽命在200h以上，價(jià)格也比較低。 國產(chǎn)高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以 注意事項(xiàng)必須安裝紫外防護(hù)罩打開汞燈后不可立即關(guān)閉汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動(dòng)工作環(huán)境溫度不宜太高，必須有良好的散熱條件汞燈的使用壽命達(dá)到300小時(shí)，需更換新燈泡 注意事項(xiàng)必須安裝紫外防護(hù)罩熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求（一）載玻片載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間（二）蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔（三）標(biāo)本組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。（四）封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH

6、8.59.5時(shí)較亮，不易很快褪去（五）鏡油一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求（一）載玻片數(shù)據(jù)記錄及處理數(shù)據(jù)記錄及處理熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別 1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別 1.照明方式通常為落射式，即光熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用1、病原體檢測快速檢測病原體，也可檢測患者血清中特異性抗體水平1、病原體檢測快速檢測病原體

7、，也可檢測患者血清中特異性抗體水2、自身抗體檢測抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)2、自身抗體檢測抗核抗體抗核抗體抗核抗體用于檢測學(xué)種種抗核抗體、抗平滑肌抗體、抗線粒體抗體等自身抗體用于檢測學(xué)種種抗核抗體、抗平滑肌抗體、抗線粒體抗體等自身抗體3、免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細(xì)胞）檢測組織中免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗原抗體復(fù)合物以及腫瘤組織中腫瘤相關(guān)抗原的堅(jiān)定3、免疫病理檢測腫瘤檢測組織中免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗原抗體復(fù)合4、細(xì)胞表面抗原和受體檢測 熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CD抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、Fc受體等的檢測以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。5、特殊應(yīng)用：流式細(xì)胞分析 將游

8、離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計(jì)的儀器中通過噴嘴逐個(gè)流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號(hào)由熒光檢測計(jì)檢測，并自動(dòng)處理各種數(shù)據(jù)。4、細(xì)胞表面抗原和受體檢測熒光免疫測定的應(yīng)用熒光免疫測定的應(yīng)用 一、時(shí)間分辨熒光免疫測定 利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素（銪(Eu3+)、釤(Sm3+)、鋱(Tb3+)、釹(Nd3+)、鏑(Dy3+)）標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時(shí)間分辨熒光儀即可測定熒光強(qiáng)度，從而推測待測物含量。一、時(shí)間分辨熒光免疫測定 利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu) 自發(fā)熒光壽命短:1ns10ns鑭系元素壽命長:10s1

9、000s短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光 1、時(shí)間分辨 自發(fā)熒光壽命短:1ns10ns1、時(shí)間分 2、stokes位移(斯托克斯 )激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差鑭系元素Stokes位移大(273nm)，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不重疊3、發(fā)射光譜和激發(fā)光譜發(fā)射光譜帶較窄：613nm10nm，干擾少 激發(fā)光譜帶較寬：300nm350nm，靈敏度高 2、stokes位移(斯托克斯 )激發(fā)光譜熒光激發(fā)光源1000次/S激發(fā)，比活性提高各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡將游離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計(jì)的儀器中通過噴嘴逐個(gè)流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號(hào)由熒光檢測計(jì)檢測，并自動(dòng)處理各種數(shù)

10、據(jù)。熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動(dòng)8、使用阻斷濾片(目前多數(shù)阻斷濾片內(nèi)置于熒光顯微鏡)激發(fā)光譜帶較寬：300nm350nm，靈敏度高2、打開高壓汞燈的電源控制箱開關(guān)。堿性磷酸酶標(biāo)記抗體或抗原，固相載體包被抗原或抗體，酶分解4-MUP，脫磷酸根基團(tuán)形成4-MU，360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm熒光。3、發(fā)射光譜和激發(fā)光譜鑭系元素壽命長:10s1000s熒光免疫技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CD抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、Fc受體等的檢測以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡采用熒光素標(biāo)記抗體與組織或細(xì)胞抗原反應(yīng)，經(jīng)過洗滌分離后，熒光顯微鏡

11、下觀察呈特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位，借此對組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測定，又稱熒光抗體技術(shù)。2、stokes位移(斯托克斯 )汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動(dòng)汞燈的使用壽命達(dá)到300小時(shí)，需更換新燈泡組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。 4、熒光標(biāo)記物的相對比活性比活性：單位時(shí)間每個(gè)標(biāo)記分子被探測的信號(hào)量熒光激發(fā)光源1000次/S激發(fā)，比活性提高5、信號(hào)增強(qiáng)熒光激發(fā)光源1000次/S激發(fā)，比活性提高 標(biāo)記方法雙抗體夾心法固相抗體競爭法固相抗原競爭法 標(biāo)記方法雙抗體夾心法 測定：蛋白質(zhì)、激素、藥

12、物、腫瘤標(biāo)記物、 病原體抗原/抗體等 測定：蛋白質(zhì)、激素、藥物、腫瘤標(biāo)記物、 病二、熒光偏振免疫測定 利用熒光素經(jīng)單一波長的偏振光照射后吸收光能，釋放出相應(yīng)的偏振熒光，熒光偏振程度與熒光分子大小成正比的關(guān)系而建立的免疫分析技術(shù)。二、熒光偏振免疫測定 利用熒光素經(jīng)單一波長的偏振 測定：藥物、維生素和激素等 測定：藥物、維生素和激素等三、熒光酶免疫測定堿性磷酸酶標(biāo)記抗體或抗原，固相載體包被抗原或抗體，酶分解4-MUP，脫磷酸根基團(tuán)形成4-MU，360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm熒光。三、熒光酶免疫測定堿性磷酸酶標(biāo)記抗體或抗原，固相載體包被抗原 酶和熒光底物標(biāo)記酶底物熒光產(chǎn)物激發(fā)光(nm)熒光(nm)相應(yīng)信號(hào)堿性磷酸酶4-MUP4-MU36045010-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根過氧化物酶HPA二聚體3174140.03 酶和熒光底物標(biāo)記酶底物熒光產(chǎn)物激發(fā)光(nm 方法類型雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法 方法類型雙抗體夾心法 測定：抗病毒抗體、細(xì)菌和